胃腺癌組織中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表達及臨床意義

胡乃軍,王海龍

錦州醫科大學附屬第一醫院普外科(錦州 121001)

胃癌是胃黏膜呈腺樣分化的一種惡性上皮性腫瘤，病變發生最常見的部位是遠端胃，即胃竇及幽門區，胃體部腫瘤主要是大彎側及小彎側[1]。胃腺癌常伴有淋巴道轉移，一般預后較差，與病變形成時的浸潤及播散有關[2]。近年研究認為腫瘤細胞播散時可以產生轉移相關蛋白[3]。MMPs家族是與轉移相關的蛋白，能對細胞外基質成分形成降解，破壞腫瘤轉移的屏障，腫瘤細胞易于離開原發灶，形成播散?；|金屬蛋白酶-11(MMP-11)和基質金屬蛋白酶-12(MMP-12)是近年發現的與轉移密切相關的蛋白，兩者可能與脈管生成相關[4]。血管內皮生長因子-D(VEGF-D)是血管內皮生長因子家族的新成員，被認為是淋巴管生成的促進因子，通過其受體VEGFR3促進間質淋巴管內皮細胞增殖并介導淋巴管新生[5]。2012年9月至2014年8月我們對胃腺癌術后組織應用流式細胞術檢測MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表達，分析其相關性及對預后判斷的價值。

資料和方法

1 一般資料 納入研究組的患者均為2012年9月至2014年8月在我院就診并手術治療的患者，共130例，納入標準：①嚴格按WHO中的標準進行確診并分型；②均為原發且首次發病。排除標準：①有其它器官惡性腫瘤；②有消化道手術史者?；颊吣挲g51～85歲，中位年齡59歲；男69例，女61例。其中高分化23例，中分化20例，低分化87例；Lauren分型中腸型45例，彌漫型85例。選擇上述患者中距腫物邊緣大于3 cm的35例非腫瘤性胃黏膜組織作為對照組，年齡55～80歲，中位年齡60歲，男18例，女17例。

2 MMP-11、MMP-12和VEGF-D表達檢測 應用流式細胞術檢測兩組術后新鮮標本中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表達。新鮮標本立即取材后應用75%酒精固定24 h以上，用剪刀將組織剪成漿糊狀，進行過濾，去除雜質后離心(2000 r/min，10 min)，取沉淀物，制備單細胞懸液(1×106/ml)，取1 ml，嚴格按實驗步驟依條件加一抗、PBS和二抗后，應用美國BD公司生產的流式細胞儀上機檢測，應用系統自帶的軟件進行數據分析。

3 結果判定 實驗結果應用熒光指數(FI)表示，FI的計算方法：FI=蛋白表達的熒光強度-對照樣品平均熒光強度/正常對照樣品平均熒光強度。

4 統計學方法 應用SAS 6.12統計學軟件進行處理，依據條件對數據行卡方檢驗、t檢驗、方差分析、生存分析和線性相關性檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 兩組中MMP-11、MMP-12和VEGF-D表達的比較 MMP-11、MMP-12和VEGF-D在兩組中的表達差別有統計學意義(P<0.01),見表1。

表1 兩組中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的比較(FI值)

注：與對照組比較，*P<0.01

2 MMP-11、MMP-12和VEGF-D在研究組不同臨床及病理特征分組中的比較 研究組中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表達與脈管浸潤、Lauren分型和淋巴結轉移相關，MMP-11、MMP-12的表達與細胞的增殖指數相關。三者與分化程度無明顯相關性。見表2。

表1 MP-11、MMP-12和VEGF-D在研究組不同臨床及病理特征分組中的比較

3 MP-11、MMP-12和VEGF-D表達的相關性分析 用線性相關性分析，結果顯示MMP-11和VEGF-D(r=0.39，P=0.0313)、MMP-12和VEGF-D(r=0.43，P=0.0213)具有正相關性。

4 MP-11、MMP-12和VEGF-D表達與生存時間的關系 研究組患者隨訪生存時間8～60個月，平均23.4個月，經生存分析顯示MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表達與生存時間相關(P<0.05)。即MMP-11、MMP-12和VEGF-D高表達患者生存時間短，預后差；MMP-11、MMP-12和VEGF-D低表達患者生存時間長，預后好。

討 論

與胃腺癌發生有關的因素包括社會經濟狀況低下、高鹽飲食等，其次胃癌的各種基因譜系如癌基因、抑癌基因、凋亡相關基因與轉移相關基因的異常改變也有關，再次與家族遺傳傾向也有明顯關聯[6]。有觀點認為幽門螺桿菌感染在胃癌發生的早期階段可以起到重要作用[7]。分子生物學和免疫化學研究發現胃腫瘤形成和進展有中可以有多種蛋白和基因表達失常，包括微衛星不穩定性、體細胞突變、APC、CyclinE、E-cadherin和nm23等表達異常等。近年流行病學結果顯示腸型胃癌的發生率逐年下降，而彌漫型腫瘤卻不斷增加，這可能與胃鏡的廣泛應用及時檢出早期胃腺癌，使患者進行治療減少了浸潤性胃癌的發生率有關，也可能與彌漫型胃腫瘤在胃鏡進行組織活檢時易漏診有關。轉移相關基因異常表達是進展期胃腺癌中的分子病理因素[8]。進展期胃腺癌表現為息肉型、蕈傘形、潰瘍型或彌漫型。腫瘤鏡下形態主要由腺管狀、腺泡狀或乳頭狀結構構成，也可以表現為不相粘著的單個細胞構成(彌漫狀分布)，腫瘤細胞廣泛浸潤或隱匿在胃壁的各層，上皮細胞的異型性明顯，伴有不同程度的分化。MMP-11和MMP-12是分泌家族轉移相關蛋白MMPs家族中的兩個重要成員，具有高度保守的鋅離子依賴蛋白水解酶[9]。MMP-11主要是經過細胞外的水解后活化，以活性酶的形式存在，能對腫瘤細胞間質的纖維和基質的改建起一定的作用[10]。有研究認為MMP-11能調節血管或淋巴管內皮細胞的生長，促進間質的淋巴細胞聚集和巨噬細胞反應[11]。MMP-12是由活化的炎細胞和惡性腫瘤細胞分泌，白細胞介素、腫瘤壞死因子、血管內皮生長因子及血小板活化因子等均可以介導MMP-12的表達，而MMP-12在正常組織中不表達[12]。MMP-12有廣泛的底物活性，能分解彈性蛋白、IV型原和層粘連蛋白，并對腫瘤間質的纖維組織有明顯的降解作用[13]。研究顯示MMP-12可以對肺纖維化和肺損傷組織的異常重建有明顯的促進作用[14]。VEGF-D是新發現的淋巴管生成促進因子，在高遷移腫瘤的進展時，腫瘤細胞可以產生大量的VEGF-D，引起間質中淋巴管內皮細胞的增生，新形成的脈管呈枝芽狀生長，在物理性條件作用下，在新生腫瘤的間質處形成管腔，與原淋巴管連接，具有脈管的播散功能，也為腫瘤細胞遷移提供了原始通道[15-16]。

本研究應用流式細胞術檢測組織中蛋白的表達，結果可進行半定量分析，客觀、可信，說服力強。實驗結果顯示在研究組中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表達明顯高于對照組，提示三者具有癌基因樣的作用，MMP-11、MMP-12和VEGF-D是腫瘤形成和進展中的重要促進蛋白。研究組中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表達與脈管浸潤、Lauren分型和淋巴結轉移相關，提示三者是與腫瘤遷移和播散相關的重要蛋白。MMP-11和MMP-12的表達與細胞的增殖指數相關，提示二者具有促進腫瘤細胞增生和繁殖的作用。由于以上因素均為與患者生存時間(預后)相關的臨床及病理指標，因此三者高表達可能與患者的生存時間或預后相關，而預后分析直接證實了此結論。研究組中MMP-11和VEGF-D、MMP-12和VEGF-D的表達具有正相關性，提示MMP-11和MMP-12均可以促進VEGF-D的表達[17]，誘導淋巴管生成。但是MMP-11和MMP-12在血管生成調節過程中的通路作用可能不確切。MMP-11、MMP-12在腫瘤進展期中的表達升高，即隨著腫瘤進展MMP-11和MMP-12分泌增加，引起腫瘤細胞生長和分化，細胞異型性明顯，增殖活躍，并能對P53和ras等基因進行調控，促進腫瘤細胞的遷移和播散[18-19]。MMP-12具有多種生物學功能，通過識別ECM及細胞膜上免疫蛋白超家族粘附分子、細胞間粘附分子等介導腫瘤細胞的粘附作用，并引起細胞信號傳導異常及調節細胞生存和增殖[20-21]。MMP-11在腺上皮惡性轉變過程中還可能通過對WNT和PI3K的信號通路進行調節起作用，由于MMP-11本身是一種分泌蛋白，其產生后不僅在細胞質中表達，還可以分泌到細胞外液體環境中，即在血液和組織液中可以檢測MMP-11的表達，因此血清中可以檢測出MMP-11的表達，其與組織中的表達可能有一定的一致性[22]。VEGF-D被認為可能與MMP-11和MMP-12有協同作用的因子，MMP-11和MMP-12可能是上游基因，調節著VEGF-D/VEGFR3等信號通路，引起細胞增殖和遷移，但是它們是否能作為淋巴管生成的直接通路有待更多實驗證實。

總之，MMP-11、MMP-12和VEGF-D在胃腺癌中的表達上調，且具有正相關性，三者對病變的形成和進展意義明顯，聯合檢測三者的表達對判斷預后可能有一定價值。