丙酮酸乙酯對百草枯中毒導致急性肺損傷大鼠高遷移率族蛋白B1/Toll樣受體4表達的影響

徐道劍，盧 翔，趙長海，盛 琦

(臺州市立醫(yī)院 急診科，浙江 臺州 318000)

百草枯(paraquat，PQ)是一種有效的除草劑，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)除草中[1]。人體一旦吸收百草枯可造成彌漫性肺損傷，進一步可發(fā)展為不可逆的肺纖維化，甚至呼吸衰竭[2]。百草枯的中毒機制尚未明確[3]，有研究報道[4]，高遷移率族蛋白B1(HMGB1)與Toll樣受體4(TLR-4)可與腫瘤壞死因子α(TNF-α)等炎癥因子相互作用而導致肺損傷。而丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate，EP)可對炎癥因子產(chǎn)生一定的抑制作用[5]。本研究擬分析EP對HMGB1、TLR-4和炎癥因子表達水平的影響，旨在探討EP治療PQ中毒的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用SD雄性大鼠141只，隨機分為PQ組、EP組及對照組各47只。SD大鼠由臺州市立醫(yī)院實驗室提供。大鼠飼養(yǎng)溫度為20～26℃，環(huán)境濕度為40%～60%，每日開箱30 min。PQ組大鼠周齡8～10周、平均9.83±1.56周，平均體重236.54±3.21 g；EP組周齡9～11周、平均9.83±1.56周，平均體重246.54±5.04 g；對照組周齡10～12周、平均11.88±1.83周，平均體重187.3246.28 g。三組大鼠平均周齡、平均體重比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 處理方法 20%的PQ水劑以40 mg/kg PQ的劑量對PQ組和EP組大鼠灌胃，建立百草枯中毒大鼠模型[5]。EP溶于乳酸鈉林格液，于PQ灌胃0.5 h后，以40mg/kg EP的劑量對EP組大鼠進行腹腔注射。PQ組與對照組腹腔注射與EP組等量的生理鹽水。三組大鼠分別在腹腔注射后6 h、12 h、24 h和48 h時，每次各隨機取4只大鼠，采用10%的水合氯醛溶液進行注射麻醉，分離頸外靜脈，抽取靜脈血，靜置后離心取血清；分離肺組織放置于RNA safetyTM組織RNA保存液(上海索寶生物科技有限公司)中保存。

1.3 觀察指標 取4 mL大鼠頸外靜脈血，進行離心操作后取血清，采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法檢測血清超氧化物歧化酶(SOD)與丙二醛(MDA)含量。采用RT-PCR法檢測大鼠肺組織中的HMGB1、TLR-4、白細胞介素-1(IL-1)及TNF-α的mRNA相對表達量。RT-PCR反應(yīng)條件為：預變性95℃ 30 s；PCR反應(yīng)95℃ 5 s，60℃ 30 s，共計40個循環(huán)。2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織mRNA表達量比較 腹腔注射后6 h、12 h、24 h及48 h，PQ組和EP組大鼠的肺組織TNF-α mRNA、HGMB1 mRNA、IL-1 mRNA、TLR-4 mRNA的表達量均高于對照組，EP組的TNF-α mRNA、HGMB1 mRNA、IL-1 mRNA、TLR-4 mRNA的表達量均低于PQ組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；見表1。

表1 三組大鼠肺組織mRNA表達量比較

注：*與PQ組比較，P<0.05；#與對照組比較，P<0.05；下同。

2.2 血清MDA和SOD含量比較 腹腔注射后6 h、12 h、24 h及48 h，PQ組和EP組大鼠血清的MDA含量均高于對照組，EP組的MDA含量低于PQ組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；腹腔注射后6 h、12 h、24 h及48 h，PQ組和EP組大鼠血清的SOD含量均低于對照組，EP組的SOD含量均高于PQ組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；見表2。

表2 三組大鼠血清MDA和SOD含量比較

3 討論

PQ中毒可對患者各個組織器官造成極大的損傷，尤其是對肺部的損傷，一般表現(xiàn)為肺充血、肺水腫等[6-8]，呼吸衰竭可造成患者死亡[9-10]。研究認為[11]，氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及免疫炎癥級聯(lián)反應(yīng)在PQ中毒所導致的肺纖維化進展中起著重要的作用。PQ可通過激活Clare細胞、I和II型肺泡上皮細胞的聚胺轉(zhuǎn)運體選擇性地在肺內(nèi)濃聚，氧化應(yīng)激反應(yīng)是PQ中毒致肺纖維化的主要起始機制之一，PQ進入肺組織后會被還原成分子基團PQ+，PQ+被氧化后形成超氧陰離子，通過SOD的歧化作用轉(zhuǎn)化為過氧化氫，最終過氧化氫通過各種作用破壞正常肺組織[12]。氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的活性氧類可與細胞膜的多不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，最終形成過氧化物，脂質(zhì)過氧化物將破壞肺組織細胞膜結(jié)構(gòu)。SOD是體內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶，其含量高低反映了機體清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化能力，MDA是常見的脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，可反映脂質(zhì)氧化所產(chǎn)生的活性氧水平[13]。

本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，百草枯中毒后不同時間點的PQ組大鼠MDA含量均明顯上升，SOD含量均明顯下降，提示PQ中毒后的大鼠肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯，產(chǎn)生較多的氧自由基，脂質(zhì)過氧反應(yīng)劇烈而導致MDA增多。HMGB1為真核生物普遍存在的高度保守的核蛋白，可激活炎性細胞炎癥部位的聚集，有助于促進炎性細胞分泌大量的炎性因子，造成組織損傷[14]。TLR-4是HMGB1介導細胞因子的必需蛋白，TLR-4也可與TNF-α、IL-1等炎性因子相互作用，進一步加劇機體組織損傷。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，百草枯中毒后PQ組大鼠肺組織的HMGB1 mRNA、TLR-4 mRNA、TNF-α mRNA、IL-1 mRNA的表達量顯著上升，提示大鼠HMGB1、IL-1、TNF-α、TLR-4均參與了PQ中毒導致的急性肺損傷的免疫炎性級聯(lián)反應(yīng)。

EP可有效抑制炎癥因子，并減少后期炎性因子釋放，具有顯著的抗氧化效應(yīng)[15]。本研究結(jié)果顯示，丙酮酸組的HMGB1 mRNA、TLR-4 mRNA、TNF-α mRNA、IL-1mRNA表達量顯著低于百草組，且MDA含量顯著低于百草組，SOD的活性水平顯著高于百草組(均P<0.05)，提示EP可控制大鼠百草枯中毒后的肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)、免疫炎性級聯(lián)反應(yīng)，減輕急性肺損傷程度。

綜上所述，百草枯中毒所致急性肺損傷可能與免疫炎癥和氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，而丙酮酸乙酯可以通過改善氧化應(yīng)激損傷和炎癥減輕百草枯中毒所致急性肺損傷。