丹防膠囊對免疫性肝纖維化大鼠肝組織IL-33和ST2表達的影響*

李 璨， 陸 爽*， 吳 君， 程明亮

(貴州醫科大學 感染病學教研室， 貴州 貴陽 550004)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是由于某些因素損傷肝細胞后發生慢性炎癥、壞死，導致大量的膠原纖維沉積于匯管區和肝小葉內的一種病理性改變，其發生的中心環節是肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)活化致使細胞外基質(extra cellular matrix，ECM)的合成和降解失衡[1]。在HF時，活化的HSC可分泌白介素33(interleukin-33，IL-33)，并能在HSC細胞膜上觀察到腫瘤發生抑制蛋白2 (suppression of tumorigenicity 2，ST2)[2]。有研究表明，當發生急性或大規模肝損傷時，IL-33的釋放可能作為組織保護機制的激活物；而在慢性損傷中，IL-33則具有促纖維化的作用[3]。丹防膠囊是一種復方制劑，前期研究發現其在豬血清誘導的大鼠免疫性HF模型中具有抗HF作用[4]。復方鱉甲軟肝片則是目前臨床上常用、療效頗佳的抗HF藥物。因此，本研究對免疫性HF模型大鼠給與丹防膠囊干預治療，觀察大鼠肝組織IL-33、ST2的表達，探討丹防膠囊對大鼠免疫性HF干預作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及藥物 40只清潔級雄性SD大鼠(180±20)g由貴州醫科大學動物實驗中心提供(SYXK黔2015-0001)，丹防膠囊(貴陽天陽公司，自制復方制劑，尚未進行新藥申報)，復方鱉甲軟肝片購于內蒙古中蒙藥科技公司(20150123)。本研究獲得貴州醫科大學倫理委員會批準(1402050)。

1.1.2主要試劑 IL-33抗體(Abcam ab207737)、ST2抗體(武漢三鷹11920-1-AP)、GAPDH抗體(Cell Signaling 14C10)、山羊抗兔二抗(中杉金橋 ZB-2301)、引物(上海生工)、TB Green premix Ex TaqII(Tli RNaseH plus)、TAKARA BIO INC RR820A、總RNA提取試劑盒(TianGen Dp 419)、primeScrip t RT reagent kit with gDNA Eraser(TAKARA BIO INC RR047A)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及處理 40只清潔級雄性SD大鼠適應性喂養1周后按隨機數字法平均分為模型組、陰性對照組、丹防組及陽性對照組，每組10只。模型組、丹防組、陽性對照組腹腔注射0.5 mL/只[4]豬血清構建大鼠肝纖維化模型，陰性對照組腹腔注射生理鹽水0.5 mL/只，2次/周，共12周。造模同時，丹防組每天予4.32 g/kg[4]丹防膠囊灌胃，陽性對照組予0.54 g/kg[4]復方鱉甲軟肝片灌胃，模型組和陰性對照組予等量生理鹽水灌胃，1次/d，共12周[4]。12周末麻醉處死大鼠，取各組大鼠肝右葉相同部位肝組織經甲醛固定后石蠟包埋，行蘇木素—伊紅(HE)染色觀察大鼠肝組織病理學改變，參照文獻[5]進行纖維化分期；剩余新鮮肝組織存于-80 ℃冰箱，用免疫組化、Western Blot及Q-PCR檢測大鼠肝組織中IL-33、ST2蛋白及IL-33 mRNA的表達。

1.2.2免疫組織化學法檢測肝組織切片IL-33、ST2表達 各組石蠟切片經二甲苯脫蠟、不同濃度酒精水化及枸櫞酸鈉液抗原修復，一抗IL-33(1∶1 000)、ST2(1∶300)4 ℃孵育過夜，二抗常溫孵育30 min。DAB試劑染色3～5 min、復染1～3 min、返藍1 min、中性樹膠封片，顯微鏡下每張切片隨機選取4個高倍鏡觀察定位，利用Image J計算平均光密度值。

1.2.3Western Blot檢測肝組織勻漿IL-33、ST2蛋白表達 利用超聲震碎提取肝組織蛋白，分別配制8%和12% SDS-PAGE凝膠后電泳及轉膜，5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，一抗IL-33(1∶1 000)、ST2(1∶2 000)、GAPDH(1∶6 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶5 000)常溫孵育50 min后ELC曝光，GAPDH作為內參，Image J對各組蛋白條帶進行灰度值分析。

1.2.4Q-PCR檢測肝組織IL-33 mRNA表達 按照試劑盒說明書提取肝組織總mRNA，逆轉錄后加入引物、模板與熒光染料，制備10 μL體系樣品進行熒光定量實時檢測。以GAPDH為內參照，每組樣本在相同條件(預變性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 60 s，重復40個循環)下重復3次，采用2-ΔΔCT值計算各組大鼠IL-33 mRNA相對表達量，引物序列見表1。

表1 Q-PCR引物序列及序列片段Tab.1 Q-PCR primer sequence and sequence fragment

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 一般情況

實驗過程中，各組大鼠一般狀態良好，正常飲食。實驗第4周，模型組1只大鼠因肺部有出血灶死亡，其余各組大鼠未出現死亡情況。

2.2 肝組織切片病理學改變

陰性對照組肝組織結構完整清晰，以中央靜脈為中心，肝細胞呈放射狀排列，在匯管區及肝組織中未見膠原纖維增生。模型組大部分肝實質被破壞，肝細胞不規則排列，匯管區可觀察到膠原纖維增生呈條索狀延伸至肝實質內形成纖維間隔，分割并破壞肝小葉，部分區域甚至形成假小葉結構。丹防組和陽性對照組的HF程度較模型組明顯減輕，大部分正常肝小葉結構保留，纖維間隔變細，無假小葉結構形成。丹防組與陽性對照組的HF程度比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：A為模型組，B為陰性對照組，C為丹防組，D為陽性對照組圖1 各組大鼠肝組織切片病理學改變(HE，×40)Fig.1 HE staining of liver tissue of rats in each group

2.3 肝組織IL-33、ST2蛋白表達

IL-33定位于細胞核，ST2定位于細胞質。與陰性對照組比較，模型組和丹防組的IL-33、ST2表達增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，丹防組和陽性對照組的IL-33、ST2表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，丹防組的IL-33、ST2表達增多，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2和圖2。

2.4 肝組織勻漿IL-33、ST2蛋白表達

與陰性對照組比較，模型組及丹防組的IL-33、ST2表達增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，丹防組與陽性對照組的IL-33、ST2表達下降，差異有統計學意義 (P<0.05)；與陽性對照組比較，丹防組的IL-33、ST2表達增多，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

表2 各組大鼠肝組織ST2及IL-33蛋白表達Tab.2 Expression of ST2 and IL-33 in liver tissue of rats in each group

(1)與模型組比較，P<0.05；(2)與陰性對照組比較，P<0.05；(3)與陽性對照組比較，P<0.05

注：A為模型組，B為陰性對照組，C為丹防組，D為陽性對照組圖2 各組大鼠肝組織ST2及IL-33蛋白表達(HE，×400)Fig.2 Expression of ST2 and IL-33 in liver tissue of rats in each group

注：A為模型組，B為陰性對照組，C為丹防組，D為陽性對照組；(1)與模型組比較，P<0.05；(2)與陰性對照組比較，P<0.05；(3)與陽性對照組比較，P<0.05圖3 各組大鼠肝組織IL-33及ST2蛋白表達Fig.3 Expression of IL-33 and ST2 protein in liver tissue of rats in each group

2.5 肝組織IL-33 mRNA的表達

與陰性對照組比較，模型組與丹防組的IL-33 mRNA表達增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，丹防組與陽性對照組的IL-33 mRNA表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，丹防組的IL-33 mRNA表達增多，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

注：A為模型組，B為陰性對照組，C為丹防組，D為陽性對照組；(1)與模型組比較,P<0.05；(2)與陰性對照組比較,P<0.05；(3)與陽性對照組比較，P<0.05圖4 各組大鼠肝組織中IL-33 mRNA表達Fig.4 Expression levels of IL-33 mRNA in liver tissue of rats in each group

3 討論

IL-33最初是在蛛網膜下腔出血后犬腦血管痙攣的研究中發現的，因其高表達而受到關注[3]，廣泛表達于固有免疫細胞、內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞等，具有細胞因子和轉錄因子雙重功能[5-7]。當發生急性或大面積肝細胞損傷時，IL-33的釋放作為組織保護機制的因子，可減輕肝細胞的受損程度；然而，在慢性肝組織損傷中，IL-33則可作為一種肝細胞受損的“預警”因子，表現出促HF的作用[3]。ST2作為IL-33的受體，在未發現其配體IL-33前，一直被認為是孤立受體[5]。研究發現，小鼠和人的ST2廣泛在心肝脾腎肺腦等多種器官中表達[8]，也在如CD4+、CD8+T細胞、T調節細胞(Tregs)等適應性免疫的細胞中表達[9]。越來越多的研究表明，IL-33/ST2通路可參與HF的發生及發展[7,10,11]。Sun Z等[2,12]發現小鼠和人纖維化肝臟中IL-33水平以及IL-33、ST2 mRNA表達均高于正常肝臟組織，其表達水平的高低與纖維化的嚴重程度呈正相關。ST2在HF的發生發展中也具有重要作用。已有研究證明，在沒有跨膜型ST2L的情況下，肝臟損傷、炎性細胞浸潤和纖維化程度降低；此外，ST2L缺陷小鼠在四氯化碳的作用下，并未觀察到膠原蛋白的增加[2]。研究還發現，在ST2缺乏的HF小鼠中，HSC的活化降低[11]。

目前，中藥制劑抗HF的研究已獲得較多驗證，且具有多靶點、副作用相對較小的優點[13-15]。丹防膠囊是由土鱉、鱉甲、漢防己、丹參、銀杏葉、黃芪、三七、龜板及熟大黃9種已被證實有較好抗纖維化效果的單方組成的復方制劑[16-23]，本實驗前期的研究發現丹防膠囊對免疫性大鼠HF有一定干預作用，其中以高劑量組效果最顯著[4]。此外，研究還發現丹防膠囊可抑制大鼠肝星狀細胞的增殖[24]。本研究在上述研究基礎上，結合其他學者關于IL-33/ST2與HF關系的研究結論，選擇了高劑量丹防膠囊對豬血清誘導的大鼠HF進行干預，同時檢測各組大鼠肝組織IL-33及ST2的表達，進一步探討丹防膠囊對大鼠免疫性HF的干預作用是否與IL-33、ST2的表達相關。

本研究結果顯示，HF組大鼠肝組織實質被廣泛破壞，匯管區可觀察到大量膠原纖維增生，有纖維間隔形成，部分區域可見典型假小葉形成，提示已成功復制豬血清誘導的免疫性大鼠HF模型。與HF組相比，丹防膠囊組、復方鱉甲軟肝片組HF程度明顯減輕，僅少部分匯管區可觀察到膠原纖維增生，纖維間隔變細，未見明顯假小葉形成。綜上提示丹防膠囊對免疫性大鼠HF有一定的干預作用。與正常肝組織比較，IL-33基因及蛋白、ST2蛋白在HF組織中表達增高，差異有統計學意義(P<0.05)，本研究結果與Sun Z等人[2]的結果一致，提示IL-33/ST2參與了HF的形成。但經丹防膠囊干預后，IL-33基因及蛋白、ST2蛋白的表達較HF組明顯下降(P<0.05)，與Sun Z[2]發現的在ST2缺乏的HF小鼠中HSC的活化降低及趙雪珂發現的丹防膠囊可抑制大鼠肝星狀細胞的增殖的研究結果相結合，提示了丹防膠囊可能通過降低IL-33、ST2的表達進而抑制HSC的增殖、活化，從而發揮其對HF的干預作用。然而，比較丹防組與陽性對照組發現，兩組大鼠肝組織病理學改變差異無統計學意義(P>0.05)，但丹防組IL-33基因及蛋白、ST2蛋白表達高于陽性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示丹防膠囊除了可以通過影響IL-33、ST2的表達進行抗HF外，可能還能通過其他信號通路發揮干預作用，需進一步探究丹防膠囊對大鼠免疫性HF干預的作用機制。

綜上，探究丹防膠囊對HF的干預機制可進一步驗證中藥有效成分抗HF在分子水平的作用機制，為今后中藥抗HF提供有效的理論依據。