白藜蘆醇對(duì)老年大鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響*

秦 起， 李 芮， 曾慶繁

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 麻醉學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)是老年患者麻醉手術(shù)后嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為精神異常、人格改變及學(xué)習(xí)記憶能力減退，嚴(yán)重影響了患者預(yù)后、降低患者生活質(zhì)量。POCD發(fā)生的機(jī)制目前尚不清楚，研究認(rèn)為麻醉及手術(shù)誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)是引起POCD的重要原因[1-2]。隨著人口老齡化及醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，大量的老年人接受麻醉手術(shù)，臨床POCD的發(fā)生率明顯增加，POCD的預(yù)防和治療顯得尤為重要。白藜蘆醇是從植物中提取的天然化學(xué)物質(zhì)，具有抗炎作用，其改善認(rèn)知功能的作用日益受到重視[3-4]。本研究擬通過(guò)觀察白藜蘆醇對(duì)老年大鼠七氟醚麻醉加剖腹探查術(shù)術(shù)后認(rèn)知功能及海馬組織氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的影響，為臨床POCD的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

七氟醚(批號(hào)79111，美國(guó)艾伯維公司)，白藜蘆醇(北京索萊寶科技有限公司)，丙二醛(MDA)試劑盒, 超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，活性氧(ROS)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒(上海欣博盛科技有限公司)。麻醉呼吸機(jī)及麻醉氣體監(jiān)護(hù)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，Morris水迷宮儀(貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

16～18月齡的健康雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量550～600 g[貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供和飼養(yǎng)，許可證號(hào)為SCXK(黔)2018-0001]，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成對(duì)照組、麻醉手術(shù)組和白藜蘆醇+麻醉手術(shù)組,每組12只。白藜蘆醇+麻醉手術(shù)組麻醉手術(shù)前連續(xù)7 d給予白藜蘆醇100 mg/kg灌胃，對(duì)照組及麻醉手術(shù)組給入等容量的1%羥甲基纖維素鈉溶液灌胃。

1.3 動(dòng)物麻醉及手術(shù)

將需要麻醉的麻醉手術(shù)組及白藜蘆醇+麻醉手術(shù)組老年大鼠置于透明的密閉塑料麻醉箱(50 cm×30 cm×30 cm)，箱底鋪一層鈉石灰,將取暖器置于箱旁60 cm，維持鼠體溫36～37 ℃,麻醉機(jī)調(diào)整為手控模式,從進(jìn)氣口吸入3%的七氟醚和2 L/min的氧氣 ,出氣口接麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀和廢氣回收罐[5-6]。檢測(cè)出氣口七氟醚及CO2濃度,麻醉箱七氟醚濃度穩(wěn)定在3%后放入手術(shù)大鼠,待大鼠翻正反射消失后將大鼠置入連接麻醉箱的麻醉面罩內(nèi)繼續(xù)麻醉并進(jìn)行剖腹探查手術(shù)；固定大鼠四肢，剪除腹部手術(shù)區(qū)毛發(fā),碘伏消毒3遍,布比卡因局部浸潤(rùn)麻醉后正中切開皮膚,切口長(zhǎng)約4～5 cm,暴露腹白線,沿著腹白線用剪刀把腹膜剪開進(jìn)入腹腔,用鑷子依次探查腹腔臟器,探查完成后用手術(shù)縫合線縫合腹膜和皮膚,手術(shù)結(jié)束后使用利多乳膏涂抹手術(shù)傷口鎮(zhèn)痛,術(shù)后把大鼠放回麻醉箱繼續(xù)麻醉。整個(gè)麻醉手術(shù)時(shí)間為2 h，麻醉過(guò)程中保持自主呼吸,密切觀察監(jiān)護(hù)儀的血氧飽和度及鼠皮膚顏色及呼吸幅度，麻醉結(jié)束后待大鼠自然清醒后放回鼠籠中。對(duì)照組大鼠不予麻醉和手術(shù)，僅吸入2 L/min的氧氣2 h。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1海馬組織ROS的測(cè)定 將大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后斷頭處死，迅速在冰上剝離海馬組織,制成單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞后BCA法測(cè)定蛋白濃度；將收集的細(xì)胞加入含有10 μmol/L的DCFH-DA無(wú)血清培養(yǎng)液中,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱撫育20 min，采用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)各組大鼠海馬組織ROS的熒光強(qiáng)度，結(jié)果以1 mg蛋白的熒光強(qiáng)度(RFU)來(lái)表示。

1.4.2海馬組織MDA、SOD含量的測(cè)定 采用TBA法測(cè)MDA的含量，WST-1法測(cè)SOD的含量。于-80 ℃冰箱取出新鮮海馬組織標(biāo)本，剪碎后加適量PBS(100 mg組織加0.9 mL)，超聲破碎儀破碎海馬組織，12 000 r/min離心10 min，取上清BCA法測(cè)定蛋白濃度，分別置于96孔板，用酶標(biāo)儀檢測(cè)，通過(guò)稀釋倍數(shù)和組織的蛋白濃度計(jì)算海馬MDA、SOD含量。

1.4.3海馬組織TNF-α、IL-1β的含量 取蛋白定量后的海馬組織勻漿上清，用ELISA試劑盒測(cè)定大鼠海馬TNF-α和IL-1β含量。用酶標(biāo)儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中TNF-α、IL-1β的濃度，根據(jù)稀釋倍數(shù)和組織的蛋白濃度計(jì)算海馬TNF-α、IL-1β的含量。

1.4.4大鼠認(rèn)知功能Morris水迷宮試驗(yàn) 術(shù)后第1天開始定向航行試驗(yàn)測(cè)逃避潛伏期，每組各取6只大鼠,每天訓(xùn)練1次(包括4個(gè)象限),每個(gè)象限60 s,連續(xù)5 d。潛伏平臺(tái)放在第IV象限內(nèi),訓(xùn)練時(shí)依次從4個(gè)象限的同一點(diǎn)將大鼠放入水中,大鼠從入水到找到潛伏平臺(tái)時(shí)間為本次逃逸潛伏期(escape latency),大鼠找到潛伏平臺(tái)后讓其在上面停留15 s ,如果大鼠在60 s內(nèi)未找到潛伏平臺(tái)則人為將其引導(dǎo)上潛伏平臺(tái)停留15 s,每天4個(gè)象限逃逸潛伏期平均值作為當(dāng)天逃逸潛伏期，連續(xù)測(cè)試5 d。在術(shù)后第6天開始空間探索實(shí)驗(yàn)測(cè)試目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間,將潛伏平臺(tái)移開,選定第II象限同一點(diǎn)為入水點(diǎn),記錄大鼠60 s內(nèi)穿過(guò)目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 海馬組織ROS、MDA及SOD含量

與對(duì)照組比較,麻醉手術(shù)組ROS、MDA含量顯著增加，SOD含量顯著下降；與麻醉手術(shù)組比較，白藜蘆醇+麻醉手術(shù)組ROS、MDA的含量顯著下降，SOD含量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 海馬組織TNF-α及IL-1β的含量

與對(duì)照組比較,麻醉手術(shù)組TNF-α、IL-1β的含量顯著增加；與麻醉手術(shù)組比較，白藜蘆醇+麻醉手術(shù)組TNF-α、IL-1β的含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠海馬組織ROS、MDA、SOD及TNF-a及IL-1β含量 Tab.1 The content of ROS，MDA，SOD ，TNF-a, IL-1β in the brain tissue of rats in each groups

(1)與對(duì)照組比較,P<0.05；(2)與麻醉手術(shù)組比較,P<0.05

2.3 大鼠認(rèn)知功能測(cè)試

與對(duì)照組比較，麻醉手術(shù)組3～5 d時(shí)逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間明顯縮短；與麻醉手術(shù)組比較，白藜蘆醇+麻醉手術(shù)組3～5 d時(shí)逃避潛伏期明顯縮短，目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

3 討論

七氟醚對(duì)人體的呼吸及循環(huán)系統(tǒng)影響較小，麻醉給藥起效快、術(shù)中維持良好、術(shù)后蘇醒快，常用于老年患者麻醉的誘導(dǎo)及維持，但是近年來(lái)關(guān)于七氟醚麻醉可能引起術(shù)后POCD的研究越來(lái)越引起重視[7-8]。POCD在臨床主要表現(xiàn)為精神異常、人格改變及學(xué)習(xí)記憶能力減退等，研究表明POCD的發(fā)生與患者年齡、麻醉、手術(shù)、術(shù)前合并癥、基礎(chǔ)認(rèn)知能力、良好教育及基因差異等多種因素有關(guān)，常發(fā)生在腹部、心臟等大手術(shù)術(shù)后[9-10]。本試驗(yàn)以老年大鼠為研究對(duì)象，采用七氟醚麻醉加剖腹探查術(shù)來(lái)模擬臨床老年患者麻醉手術(shù)過(guò)程，術(shù)后24 h后通過(guò)Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)評(píng)價(jià)處理因素對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示與比對(duì)照組相比，麻醉手術(shù)組老年大鼠術(shù)后第3～5天的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間明顯縮短，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明老年大鼠七氟醚麻醉加剖腹探查術(shù)術(shù)后出現(xiàn)了早期認(rèn)知功能障礙。文獻(xiàn)報(bào)道白藜蘆醇100 mg/kg灌胃可以緩解小鼠異氟醚麻醉后的認(rèn)知減退[11]。本次試驗(yàn)采用此試驗(yàn)方案，每天給入100 mg/kg的白藜蘆醇，連續(xù)灌胃7 d，結(jié)果顯示,與麻醉手術(shù)組相比，白藜蘆醇+麻醉手術(shù)組老年大鼠第3～5天時(shí)逃避潛伏期明顯縮短，探索時(shí)間延長(zhǎng)，說(shuō)明上述試驗(yàn)劑量的白藜蘆醇灌胃對(duì)老年大鼠七氟醚麻醉加剖腹探查術(shù)POCD產(chǎn)生了保護(hù)作用。

表2 3組大鼠Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果Tab.2 Comparison of Morris water maze test in each group

(1)與對(duì)照組比較,P<0.05；(2)與麻醉手術(shù)組比較,P<0.05

POCD發(fā)生的確切機(jī)制目前尚不清楚，大量的研究認(rèn)為是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)衰老的基礎(chǔ)上由麻醉和手術(shù)刺激誘發(fā)，多種因素綜合作用的結(jié)果，而氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)在其中扮演重要作用[12]。海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位，麻醉和手術(shù)誘發(fā)的強(qiáng)烈而持續(xù)的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)會(huì)造成海馬損傷，影響學(xué)習(xí)記憶能力，從而誘發(fā)POCD[13]。在試驗(yàn)中，麻醉手術(shù)組老年大鼠海馬組織的ROS、MDA、TNF-a、IL-1β含量明顯增加，SOD含量明顯下降，說(shuō)明氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)在誘發(fā)POCD的作用中確實(shí)起著重要作用，與上述的研究結(jié)論一致。進(jìn)一步的研究表明，麻醉后脾切除的大鼠發(fā)生POCD與促炎介質(zhì)的合成增多有關(guān)，減輕促炎介質(zhì)的釋放是防治術(shù)后POCD的關(guān)鍵[14]。白藜蘆醇廣泛存在于自然界的植物中,具有抗氧化應(yīng)激、抗感染、調(diào)節(jié)糖脂代謝、神經(jīng)保護(hù)、延緩衰老等多種作用。李浩等[15]研究表明白藜蘆醇對(duì)肥胖大鼠異氟醚麻醉后的認(rèn)知功能有明顯保護(hù)作用。有研究認(rèn)為術(shù)前單次給入白藜蘆醇并沒(méi)有保護(hù)作用，而給入載有白藜蘆醇的納米乳劑可降低手術(shù)后TNF-a、IL-1β含量，改善術(shù)后認(rèn)知[16]。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)7 d白藜蘆醇灌胃處理后老年大鼠海馬組織ROS、MDA含量明顯降低，SOD含量明顯增加，TNF-a、IL-1β含量明顯降低，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中的白藜蘆醇劑量可以降低老年大鼠麻醉術(shù)后海馬組織的氧化應(yīng)激及炎癥水平，對(duì)老年大鼠的認(rèn)知產(chǎn)生了保護(hù)作用。

綜上所述，白藜蘆醇灌胃后通過(guò)降低老年大鼠七氟醚麻醉加剖腹探查術(shù)術(shù)后海馬組織的氧化應(yīng)激及炎癥水平，對(duì)認(rèn)知有保護(hù)作用。由于白藜蘆醇來(lái)源廣泛，副作用少，作用機(jī)制明確,是SIRT1受體最強(qiáng)激活劑[17]，具有有廣泛的應(yīng)用前景，接下來(lái)的試驗(yàn)有必要對(duì)白藜蘆醇的安全劑量及可能的機(jī)制做更進(jìn)一步研究探討，為臨床麻醉術(shù)后POCD的預(yù)防和治療提供新策略。