含氟或氯取代的馬蹄金素衍生物的合成及其抗乙肝病毒活性研究*

況安香， 曾曉萍， 曹 盼1,， 梁光義***， 徐必學***

(1.貴州中醫藥大學， 貴州 貴陽 550025; 2.貴州醫科大學 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室， 貴州 貴陽 550014; 3.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室， 貴州 貴陽 550014)

乙型肝炎(乙肝)是由乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起的、嚴重威脅人類健康的疾病之一[1]，目前治療乙肝的藥物主要有以α-干擾素為代表的生物類免疫調節劑和恩替卡韋等為代表的核苷(酸)類藥物[2-3]，但這些藥物均不能完全治愈乙肝[4-5]，因此，研究開發具有新化學結構類型的乙肝治療藥物具有重要意義。馬蹄金素[N-(N-苯甲酰基-L-苯丙氨酰基)-O-乙酰基-L-苯丙氨醇，MTS，圖1]是本課題組從苗藥馬蹄金中發現的一個具有抗乙肝病毒活性的先導化合物[6-8]，其衍生物Y101已經獲得臨床批件并完成了一期臨床試驗[9-11]。鑒于MTS為二肽基本母核，與現在臨床上的核苷類抗乙肝藥物的基本骨架完全不同，值得廣泛深入探討MTS基本母核上不同取代基對其抗乙肝病毒的影響。對生物分子用鹵素(Cl、Br、I和F)修飾是藥物化學研究的熱點，約40%的鹵化藥物進入市場或臨床前試驗階段，約25%的有機鹵化藥物進入市場，而34%的鹵化藥物仍處于研發階段[12- 13]，這表明鹵素在藥物研發中起著重要的作用，其中又以含氟或氯取代的應用更為廣泛[14]。為探討含氟或氯取代對MTS衍生物在抗HBV活性方面的影響，本研究設計合成了一系列含氟或氯取代的MTS衍生物，并對其進行了抗HBV的評價。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑

儀器有XT-4型熔點儀(溫度未校正)、德國布魯克公司AVANCE NEO-600 MHz型超導核磁共振儀、美國Varian公司Inova-400 MHz型超導核磁共振儀(以TMS為內標)、美國Hewlett-Packard公司HP-5793質譜儀、青島海洋化工廠生產的柱色譜硅膠(300～400目)及高效薄層板。試劑均為市售分析純或化學純產品，除特別說明外，未經處理直接使用。2.2.15細胞為 HBV DNA克隆轉染人肝癌細胞。

1.2 試驗方法

1.2.1目標化合物3a、3b和4a～4c合成 參照文獻[8]的方法，取L-酪氨酸甲酯鹽酸鹽1.1 mmol與 2-氯苯甲酸(4-氟苯甲酸或4-氯苯甲酸)1.0 mmol于反應瓶中，加入無水二氯甲烷(DCM)50 mL和N-甲基嗎啉(NMM)2.3 mmol攪拌溶解完全，于0 ℃氬氣保護下滴加含氯甲酸異丁酯(IBCF) 126 μL(1.0 mmol)和DCM 2 mL的混合溶液，0 ℃繼續攪拌5 h。減壓回收DCM，殘留物用乙酸乙酯和水分散，萃取；所得有機層依次以蒸餾水、稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉、飽和氯化鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干；將所得固體物溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)2 mL中，加入1.0 moL/L氫氧化鈉溶液3 mL，室溫攪拌1 h，反應液以濃鹽酸調至pH 2～3，加入乙酸乙酯和水，萃取；所得有機層依次以蒸餾水、飽和氯化鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮至干即得中間體N-(2-氯-苯甲酰基)-L-酪氨酸(2a)、N-(4-氟-苯甲酰基)-L-酪氨酸(2b)、N-(4-氯-苯甲酰基)-L-酪氨酸(2c)；將前一步合成的中間體2a1.0 mmol與L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽1.1 mmol于反應瓶內，加入無水DCM 50 mL和NMM 2.3 mmol攪拌溶解完全，于0 ℃氬氣保護下滴加含IBCF 126 μL(1.0 mmol)和DCM 2 mL的混合溶液，后0 ℃繼續攪拌5 h，反應液減壓回收DCM，剩余物以乙酸乙酯和水分散，萃取，所得有機層依次用蒸餾水、稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉以及飽和氯化鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干，所得固體經硅膠柱層析純化得狀目標化合物3a。參照合成3a的方法可制備得3b和4a～4c。合成路線見圖2。

1.2.1.1N-[N-(2-氯苯甲酰基)-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨酸甲酯(3a) 白色粉末，收率74.5%。EI-MSm/z: 480 (M+),325,274,180,163,139 (100),120,107,91,77;1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:9.20 (s,1H),8.52 (d,J=8.8 Hz,1H),8.43 (d,J=8.0 Hz,1H),7.46～7.16 (m,9H),7.07 (d,J=8.4 Hz,2H),6.66 (d,J=8.4 Hz,2H),4.64 (m,1H),4.53 (m,1H),3.59 (s,3H),3.07-2.67 (m,4H);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 171.8,171.2,165.9,155.8,137.0,136.4,130.8,130.2,130.0,129.6,129.2,128.9,128.3,127.8,126.9,126.6,114.8,54.4,53.8,51.9,36.7,36.5。

1.2.1.2N-[N-(4-氟苯甲酰基)-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨酸甲酯(3b) 白色粉末，收率68.4%。EI-MSm/z: 464 (M+),325,258,180,163,147,123 (100),95;1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 9.20 (s,1H),8.55 (m,2H),7.86 (m,2H),7.30～7.13 (m,7H),7.04 (d,J=8.4,2H),7.02 (d,J=8.4,2H),4.64 (m,1H),4.50 (m,1H),3.59 (s,3H),3.09～2.79 (m,4H);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 171.8,171.8,165.1,162.7,155.7,137.1,130.6,130.5,130.2,130.1,130.0,129.1,128.3,126.6,115.2,115.0,114.8,54.9,53.7,51.9,36.6,36.2。

1.2.1.3N-[N-(2-氯苯甲酰基)-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(4a) 淡黃色粉末，收率84.9%。EI-MSm/z: 452 (M+),434,297,274,206,139 (100),120,107,91,77;1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 9.19 (s,1H),8.50 (d,J=8.4 Hz,1H),7.78 (d,J=8.8 Hz,1H),7.46～7.16 (m,9H),7.04 (d,J=8.4 Hz,2H),6.65 (d,J=8.4 Hz,2H),4.83 (t,J=5.6 Hz,1H),4.56 (m,1H),3.91 (m,1H),3.34～3.24 (m,2H),2.91～2.85 (m,2H),2.74-2.63 (m,2H);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 170.5,165.8,155.7,139.0,136.5,130.8,130.2,130.0,129.6,129.2,128.9,128.1,127.9,126.9,125.9,114.5,62.1,54.8,52.3,36.8,36.4。

1.2.1.4N-[N-(4-氟苯甲酰基)-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(4b) 白色粉末，收率66.9%。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 9.18 (s,1H),8.51 (d,J=8.4 Hz,1H),7.90～7.87 (m,3H),7.31～7.00 (m,6H),6.63 (d,J=8.4 Hz,2H),4.83 (t,J=5.6 Hz,1H),4.60 (m,1H),3.90 (m,1H),3.38～3.23 (m,2H),2.95～2.56 (m,4H);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 171.3,171.1,165.0,162.7,155.7,139.1,130.1,130.0,129.2,128.4,128.1,125.9,115.2,115.0,114.8,69.8,55.2,52.5,36.5,36.4。

1.2.1.5N-[N-(4-氯苯甲酰基)-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(4c) 白色粉末，收率55.3%。EI-MSm/z: 452 (M+),434,297,274,206,139 (100),120,107,91,77;1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 9.15 (s,1H),8.54 (d,J=8.4 Hz,1H),7.87 (d,J=8.4 Hz,1H),7.81 (d,J=8.4 Hz,2H),7.53 (d,J=8.4 Hz,2H),7.25～7.12 (m,5H),7.07 (d,J=8.0 Hz,2H),6.60 (d,J=8.0 Hz,2H),4.80 (t,J=5.2 Hz,1H),4.57 (m,1H),3.88 (m,1H),3.35～3.24 (m,2H),2.95～2.60 (m,4H);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 170.9,164.9,155.7,139.0,136.1,132.9,130.1,129.4,129.2,128.33,128.28,128.1,125.9,114.8,62.2,55.2,52.5,36.5,36.4。

1.2.2目標化合物5a～5e的合成通法 取化合物4c1.0 mmol與碳酸鉀3.0 mmol于反應瓶內，加入DMF 10 mL，攪拌下加入碘甲烷1.1 mmol，室溫攪拌至反應完全，將反應液分散于乙酸乙酯和水中，萃取，所得有機層依次以水、飽和氯化鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干，所得固體經硅膠柱層析純化即得5a。同法，以碘代乙烷、碘代丙烷、碘代異丙烷或二甲氨基氯乙烷鹽酸鹽替換碘甲烷，可分別制得5b～5e。合成路線見圖2。

1.2.2.1N-[N-(4-氯苯甲酰基)-O-甲基-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(5a) 白色粉末，收率76.5%。ESI-MSm/z: 955.5 [2M+Na]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 8.57 (d,J=8.5 Hz,1H),7.90 (d,J=8.4 Hz,1H),7.84～7.78 (m,2H),7.55～7.50 (m,2H),7.25～7.15 (m,6H),7.16～7.09 (m,1H),6.82～6.76 (m,2H),4.83 (t,J=5.4 Hz,1H),4.64～4.57 (m,1H),3.92～3.84 (m,1H),3.67 (s,3H),3.33 (dd,J=10.6,5.1 Hz,1H),3.27 (dd,J=10.8,5.7 Hz,1H),2.95 (dd,J=13.8,4.5 Hz,1H),2.89～2.83 (m,2H),2.66 (dd,J=13.7,8.0 Hz,1H);13C-NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ: 171.01,165.11,157.78,139.06,136.18,132.87,130.23,129.44,129.27,128.37,128.14,125.99,113.51,62.28,55.22,54.95,52.54,36.47。

1.2.2.2N-[N-(4-氯苯甲酰基)-O-乙基-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(5b) 參考5a合成方法，以碘乙烷替換碘甲烷合成目標化合物5b，白色粉末，收率60.6%。ESI-MSm/z: 503.2 [M+Na]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 8.56 (d,J=8.5 Hz,1H),7.88 (d,J=8.4 Hz,1H),7.85～7.79 (m,2H),7.57～7.50 (m,2H),7.25～7.16 (m,6H),7.16～7.09 (m,1H),6.81～6.75 (m,2H),4.79 (t,J=5.5 Hz,1H),4.66～4.59 (m,1H),3.96～3.87 (m,3H),3.38～3.31 (m,1H),3.31～3.26 (m,1H),2.96 (dd,J=13.8,4.6 Hz,1H),2.88 (dd,J=8.0,2.4 Hz,1H),2.86 (dd,J=7.9,2.1 Hz,2H),2.67 (dd,J=13.6,8.0 Hz,1H),1.28 (t,J=6.9 Hz,3H);13C-NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ: 171.38,165.48,157.46,139.48,136.55,133.32,130.62,130.51,129.84,129.66,128.75,128.53,126.36,114.38,63.24,62.68,55.60,52.94,36.88,15.15。

1.2.2.3N-[N-(4-氯苯甲酰基)-O-丙基-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(5c)制備 參考5a合成方法，以碘丙烷替換碘甲烷合成目標化合物5c，白色粉末，收率71.1%。ESI-MSm/z: 517.2 [M+Na]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 8.56 (d,J=8.5 Hz,1H),7.89 (d,J=8.3 Hz,1H),7.83 (d,J=8.2 Hz,2H),7.53 (d,J=8.2 Hz,2H),7.26～7.16 (m,6H),7.13 (t,J=7.6 Hz,1H),6.79 (d,J=8.2 Hz,2H),4.79 (t,J=5.5 Hz,1H),4.62 (td,J=9.4,4.4 Hz,1H),3.91～3.86 (m,1H),3.84 (t,J=6.6 Hz,2H),3.37～3.32 (m,1H),3.31～3.26 (m,1H),2.96 (dd,J=13.9,4.5 Hz,1H),2.87 (dd,J=14.0,8.0 Hz,2H),2.67 (dd,J=13.8,8.0 Hz,1H),1.71～1.64 (m,2H),0.94 (t,J=7.4 Hz,3H);13C-NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ: 171.38,165.50,156.35,139.48,136.55,133.33,130.66,130.40,129.84,129.66,128.74,128.52,126.36,115.62,69.36,62.68,55.60,52.95,36.91,36.88,22.31。

1.2.2.4N-[N-(4-氯苯甲酰基)-O-異丙基-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(5d)的制備 參考5a合成方法，以碘代異丙烷替換碘甲烷合成目標化合物5d，白色粉末，收率60.9%。ESI-MSm/z: 517.2 [M+Na]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 8.57 (d,J=8.5 Hz,1H),7.88 (d,J=8.4 Hz,1H),7.85～7.81 (m,2H),7.56～7.50 (m,2H),7.25～7.17 (m,6H),7.16～7.10 (m,1H),6.80～6.74 (m,2H),4.79 (t,J=5.5 Hz,1H),4.66～4.59 (m,1H),4.56～4.48 (m,1H),3.96～3.86 (m,1H),3.38～3.32 (m,1H),3.31～3.26 (m,1H),2.96 (dd,J=13.9,4.7 Hz,1H),2.92～2.83 (m,2H),2.67 (dd,J=13.7,8.0 Hz,1H),1.21 (d,J=1.6 Hz,3H),1.20 (d,J=1.5 Hz,3H);13C-NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ: 171.38,165.50,156.35,139.48,136.55,133.33,130.66,130.40,129.84,129.66,128.74,128.52,126.36,115.62,69.36,62.68,55.60,52.95,36.91,36.88,22.31。

1.2.2.5N-[N-(4-氯苯甲酰基)-O-二甲氨基乙基-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(5e) 白色結晶，收率46.6%。ESI-MSm/z: 525.2 [M+H]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 8.57 (d,J=8.5 Hz,1H),7.89 (d,J=8.3 Hz,1H),7.85～7.80 (m,2H),7.57～7.51 (m,2H),7.26～7.16 (m,6H),7.16～7.11 (m,1H),6.84～6.77 (m,2H),4.80 (t,J=5.5 Hz,1H),4.66～4.59 (m,1H),3.96 (t,J=5.9 Hz,2H),3.94～3.87 (m,1H),3.38～3.31 (m,1H),3.31～3.27 (m,1H),2.97 (dd,J=13.8,4.5 Hz,1H),2.91～2.84 (m,2H),2.67 (dd,J=13.7,8.0 Hz,1H),2.56 (d,J=11.8 Hz,2H),2.18 (s,6H);13C-NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ: 171.38,165.49,157.44,139.47,136.56,133.31,130.63,129.84,129.66,128.75,128.53,126.36,114.47,66.09,62.68,58.21,55.60,52.95,46.02,36.89。

圖2 目標化合物的合成路線圖Fig.2 Synthetic route for target compounds

1.3 馬蹄金素衍生物體外抗HBV活性研究

取2.2.15細胞接種96孔培養板，24 h后加入不同濃度的樣品液(3a、3b、4a、4b、4c、5a、5b、5c、5d、5e、MTS)、空白對照液或拉米夫定(lamivudine)陽性對照液。培養3 d后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續培養6 h，1 000 r/min離心10 min，吸去孔內培養液，每孔加入DMSO 200 μL，振蕩10 min，形成的結晶充分溶解后、用酶聯免疫檢測儀測定其吸光度值(OD值)，采用改良寇氏法計算藥物的半數有毒濃度。另取2.2.15細胞接種96孔培養板，24 h后分別加入不同濃度的樣品(3a、3b、4a、4b、4c、5a、5b、5c、5d、5e、MTS)及陽性對照藥拉米夫定，同時設細胞對照孔，加藥后每72 h分別更換含不同稀釋濃度樣品的培養液，于加藥后第8日分別收集2.2.15細胞，采用斑點雜交的方法檢測細胞中HBV DNA的復制程度，分別計算IC50及藥物選擇性指數(SI)[15]。

2 結果

通過化學方法合成了10個含氟或氯取代的MTS衍生物，并對所合成的目標產物進行體外抗HBV 活性測試，結果顯示其中有8個目標產物對HBV DNA的復制有不同程度的抑制活性。化合物5a、5c、5d表現出良好的抗HBV活性，其IC50為12.61、10.53、6.46 μmol/L。見表1。

表1 目標化合物對2.2.15細胞DNA復制的抑制活性Tab.1 Inhibitory effect of the target compounds on HBV DNA in 2.2.15 cell

注：“-”表示樣品在測試濃度范圍內無活性

3 討論

本文以具有抗HBV活性的MTS為先導化合物，通過在其B環引入氟或氯取代，設計合成了10個衍生物，由表1中目標化合物的抗HBV活性測試結果可以看出，A環為4-羥基取代的化合物活性相對較低；對化合物4c中A環4-位酚羥基進行甲基化、丙基化或異丙基化取代后所得化合物5a、5c、5d的抗HBV活性顯著提高，特別是其中甲基化取代的化合物5a，其細胞毒性還略有降低，SI達到53.0，說明含氟或氯原子取代的MTS衍生物具有進一步研究的價值。