miR-522-3p通過靶向結合PTEN促進心肌肥厚*

張 營， 吳 晟， 鮑海龍， 劉興德,2***

(1．貴州醫科大學附院 心內科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州中醫藥大學, 貴州 貴陽 550025)

心肌肥厚是心肌細胞為了彌補外來或內在的刺激造成的心臟功能障礙而出現的自主代償過程，包括心肌細胞體積增大、心肌蛋白合成增加以及肌節目增加[1-2]。加上炎癥反應、心肌纖維化改變繼而可出現心臟收縮和舒張功能障礙，導致全世界發病率和死亡率最高的心力衰竭疾病的發生[3-4]。微小RNA(miRNA)是一類長約18～22個堿基的非編碼小RNA，可結合在靶基因mRNA的3端非編碼區(3′UTR)繼而調控基因的轉錄[5-6]。多種miRNA被證實在心血管疾病中發揮重要作用，比如miR-21被證實可調控心肌纖維化中的MAPK通路繼而導致心力衰竭加重[7]；miR-24可抑制小鼠從代償性心肌肥厚向失代償性心肌肥厚的轉變過程[8]。本實驗旨在證實心力衰竭病理生理過程中miR-522-3p表達出現改變，且miR-522-3p可以參與心肌肥厚的發展過程中。

1 材料與方法

1.1 主要材料

H9C2細胞系由華中科技大學附屬同濟醫院高血壓研究所饋贈，miR-522-3p 逆轉錄引物、miR-522-3p mimic購自廣州銳博生物有限公司，Realtime-PCR相關SYBR試劑購自Takara公司，引物合成由漢天一輝遠公司完成，pMIR 熒光報告基因載體購自武漢天一輝遠公司，轉染試劑Lipofectamine2000購自invitrogen公司，雙熒光素酶報告檢測試劑購自美國Promega公司，AngII購自美國sigma公司，BNP 和ANP 抗體購自美國 Abcam 公司，PTEN、 p-AKT、 total AKT購自美國Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息學分析 登錄NCBI GEO數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)選用芯片分析數據(GSE61741)。

1.2.2動物實驗 將8周左右的雄性C57小鼠分為sham組(n=6)和TAC組(n=6)，兩組適應性喂養2周后行手術。Sham組僅行手術切開暴露胸骨，TAC組暴露胸骨后用7.0手術線進行主動脈結扎。手術后4周進行小鼠心臟超聲檢測，然后處死小鼠，取出心肌組織以待后續實驗。所有動物操作均經過了倫理委員會審查與批準。

1.2.3熒光報告基因實驗 將HEK293T細胞接種在24孔板中，待細胞密度至1×106細胞/孔時，將400 ng pMIR-PTEN 3′UTR-wild type與miR-522-3p mimic(100 mmol/L)或mimic control(100 nmol/L)共轉染，另將400 ng pMIR-PTEN 3′UTR-mutant載體與miR-522-3p mimic(100 mmol/L)或mimic control(100 nmol/L)共轉染，共計4組(即pMIR-PTEN 3′UTR-WT+mimic control組、pMIR-PTEN 3′UTR-WT+miR-522-3p mimic組、pMIR-PTEN 3′UTR-MU+mimic control組、pMIR-PTEN 3′UTR-MU+miR-522-3p mimic組)。細胞培養于37 ℃、5% CO2的培養箱中，24 h后換液，48 h后用冷磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗細胞，用被動裂解緩沖液裂解細胞(Promega,WI,USA)，反復凍融3遍保證細胞充分裂解。使用熒光素酶活性發光計(SIRIUS,Pforzheim,Germany)測量熒光素酶的表達水平。每組選取4個副孔，重復3次獨立實驗。

1.2.4過表達miR-522-3p實驗 將H9C2細胞接種與細胞培養皿中，待密度達70%時，分別將miR-522-3p mimic(100 nmol/L)、mimic control(100 nmol/L)轉染進細胞，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，24 h后換液，48 h后收取細胞，提取蛋白及RNA以待后續實驗。部分實驗中，轉染24 h后加用1 mmol/L AngII干預，干預24 h再收取細胞提取蛋白及RNA。

1.2.5實時定量聚合酶連反應(Real-time PCR) 按Trizol法提取sham組與TAC組小鼠的心肌組織，同時提取干預后的H9C2細胞總RNA。測定濃度，選擇同樣量的RNA(500 ng)進行逆轉錄。將cDNA與引物、SYBR混合，制備10 μL體系樣品， 按95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s(40個循壞)，95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、95 ℃ 15 s，完成反應。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 The list of primer sequences

1.2.6蛋白檢測(Western Blot) 按標準法提取蛋白。將蛋白樣品與加樣緩沖液混合，密封放入沸騰的水浴鍋中煮沸5 min，-20 ℃保存。完成相關準備，制膠、上樣、電泳、轉膜、封閉2 h、一抗孵育4 ℃過夜，二抗室溫孵育1 h，曝光。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0對數據進行分析，計量資料采用均數±標準誤表示。同組數據兩兩比較選用t檢驗，組內數據采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學分析結果

NCBI數據庫中選取芯片(GSE61741)分析疾病組與對照組外周血中miRNA的表達差異，結果顯示，與對照組比較，缺血性心力衰竭組和非缺血性心力衰竭組中miR-522-3p的表達均顯著升高(P<0.001)，見圖1A。

2.2 小鼠心肌中miR-522-3p與PTEN表達

對小鼠進行TAC建模，4周后行超聲檢查，可見TAC組小鼠心肌明顯肥厚，射血分數下降(圖1B)。實時定量結果顯示，TAC組小鼠心肌組織中miR-522-3p表達顯著升高[(112.1±20.9)%，P<0.01)]，見圖1C；同時發現，TAC組小鼠心肌組織PTEN基因mRNA表達明顯下降[(-40.0±0.9)%，P<0.01)]，miR-522-3p的表達與PTEN表達負相關(r=0.545,P<0.01)，見圖1。

2.3 miR-522-3p靶向調控PTEN通路

選用Targetscan7.0(www.targetscan.org)對miR-522-3p進行靶向結合位點預測，發現miR-522-3p可結合在PTEN基因3’UTR區，如圖2A。熒光報告基因實驗結果顯示，與mimic control組比較，miR-522-3p mimic明顯抑制PTEN 的轉錄活性(P<0.001)，亦抑制了PTEN的表達(P<0.01)。突變結合位點后，miR-522-3p mimic并未影響PTEN的表達活性(圖2B)；同樣的AKT、pAKT，mTOR的表達也受到影響(P<0.01)，見圖2C。

2.4 miR-522-3p對AngII干預的心肌細胞的影響

AngII干預H9C2細胞后，可見PTEN蛋白和mRNA表達水平下降，miR-522-3p使PTEN的表達下降得更明顯，差異有統計學意義(P<0.01)。心肌肥厚相關分子指標ANP、BNP、βMHC表達上升，而miR-522-3p mimic使這種上升更加明顯，差異有統計學意義(P<0.05),見圖3。

3 討論

心力衰竭是最常見的心血管疾病且是大部分心血管疾病的終末階段[9]，而它的生物學基礎--心肌肥厚可以受多種信號通道調控，如Akt、PI3K、MAPK、AMPK、GPCRs等信號通路[1]。研究者認為這些信號通路的調控者可以調控整個心肌肥厚過程達到改善或逆轉心肌肥厚的目的，繼而治療心力衰竭,比如PINK1基因可以調控AMPK的表達影響心肌細胞自噬過程繼而影響心力衰竭[10]。故而GRCPs下游β受體阻滯劑被應用于臨床心力衰竭患者，CIBIS-II、MERIT-HF、COPERNICUS三大臨床實驗證實β受體阻滯劑的應用大大改善了心力衰竭患者的預后[11-13]。

注：A為GSE芯片數據，B為心臟超聲結果,C為心功能指標，D為中心肌組織miR-522-3p的表達，E為PTEN表達，F為miR-522-3p與PTEN表達的關聯性分析；(1)與對照組比較， P<0.05圖1 心力衰竭與對照組中miR-522-3p的表達Fig.1 The expression of miR-522-3p in heart failure group and control group

注：A為預測miR-522-3p結合在PTEN基因3′UTR區，B為在293T細胞系中熒光報告基因檢測miR-522-3p與PTEN的相互作用，C為miR-522-3p調控PTEN/Akt/mOTR通路；(1)與對照組比較，P<0.001圖2 miR-522-3p靶向調控PTEN通路情況Fig.2 miR-522-3p regulated PTEN/Akt/mTOR pathway through targeting PTEN

(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與AngII+mimi NC組比較，P<0.05圖3 miR-522-3p對AngII干預的心肌細胞的影響Fig.3 The effect of miR-522-3p on Ang II-mediated Cardiomyocytes

但隨著心力衰竭的發病率致死率逐年增高[14]，人們不滿足于僅僅使用β受體阻滯劑治療心力衰竭，更多心肌肥厚過程中的調控者被人們關注起來。腦啡肽酶抑制劑(ARNI)被證實可以產生良好的心力衰竭治療作用[15]，同時miRNA也是一大熱點。miR-522-3p最早被報道于肥胖相關疾病中[16]，結合在肥胖高度相關的基因上，結合處SNP位點突變破壞結合影響基因的表達，繼而隨著SNP突變出現不同肥胖表型。后續多個研究報道顯示miR-522-3p可以促進癌細胞的增值、遷移且與腫瘤的預后相關[17-19]。本研究結合GSE數據庫，首次發現在心力衰竭患者組中循環miR-522-3p的表達明顯高于對照組，但血中循環miRNA的表達與組織miRNA表達是具有差異性的。為了驗證心力衰竭患者的心肌組織中miR-522-3p也是高表達，本實驗設計了小鼠TAC模型驗證。造模后4周心臟超聲顯示TAC組小鼠心肌明顯肥厚且心功能下降，提示造模成功。對心肌組織進行實時定量PCR測定，發現miR-522-3p的表達明顯升高。由此看來，miR-522-3p可能不僅僅參與腫瘤相關疾病。

與此同時，該研究還發現心力衰竭小鼠中PTEN的表達下降，與miR-522-3p的表達負相關。通過靶點預測，發現miR-522-3p靶向結合在PTEN基因的3’UTR區，這與大多miRNA-mRNA結合方式吻合。而PTEN被發現在心肌細胞、成纖維細胞和內皮細胞中普遍表達，且可負性調控PI3K信號通路[20]。而且PTEN/Akt信號通路，近來亦被證實是與心肌肥厚密切相關的[21]。本研究證實，過表達miR-522-3p后PTEN的表達活性明顯下降，且PTEN/Akt/mTOR信號通路的表達受到明顯影響。這個發現為miR-522-3p調控心肌肥厚提供了理論支持點。為了證實這種可能，本實驗使用了體外心肌肥厚細胞模型。在AngII誘導H92C細胞中，ANP、BNP、βMHC這些心肌肥厚相關分子指標明顯上升。過表達miR-522-3p，這些指標進一步上升，提示心肌肥厚加重。本研究認為，miR-522-3p通過調控PTEN/Akt/mTOR信號通路繼而調控心肌肥厚。

綜上所述，本實驗首次發現心力衰竭中miR-522-3p表達上升。PTEN基因表達下降，二者呈負性相關。繼而在H9C2細胞中過表達miR-522-3p，發現明顯抑制PTEN/AKT信號通路。與此同時，在AngII干預的H9C2細胞模型中，過表達miR-522-3p，增加心肌肥厚相關的ANP、BNP、βMHC蛋白的表達。但本實驗沒有在動物層面進行進一步驗證miR-522-3p是否會對心臟超聲影像學、心肌組織形態學等層面造成影響，缺乏更多更嚴謹的證據證實本研究的設想。不過就目前結果，為后續實驗提供了一個新的思路，也為抗心肌肥厚治療提供了一個新靶標。