22個Y-SNP在貴州滿族人群的分布*

張秀秀， 國學(xué)紅， 喻艷琴， 朱衛(wèi)芳， 張 婷， 王嬋娟， 單可人， 何 燕*， 吳昌學(xué)*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 3.宿遷子淵司法鑒定所， 江蘇 宿遷 223800)

按語言學(xué)分類滿族屬阿爾泰語系滿-通古斯語族群，起源于東北最古老的民族肅慎[1]，其主體稱謂經(jīng)歷了肅慎、挹婁、勿吉、靺鞨、女真和滿族[2]。公元1644年，滿族建立了清朝。清初，因平定明王朝殘部反清勢力和吳三桂叛清，清軍兩次入黔(公元1648年和1680年)，并于戰(zhàn)后聚居在貴州畢節(jié)黔西、金沙、大方三縣結(jié)合部[3]，400 余年來以“小聚居”形式與當(dāng)?shù)仄渌谰用褡濉按箅s居”在一起。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是在基因組水平上由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，且具有遺傳穩(wěn)定，靈敏度高等優(yōu)點[4]。Y染色體非重組區(qū)SNP位點稱為Y-SNP，在遺傳學(xué)上同一染色體上進行共同遺傳的多個基因座上等位基因的組合稱為單倍型。在群體遺傳學(xué)中，祖先單倍型與所有后代單倍型合稱為一個單倍群，一個家族的所有 Y 染色體理論上都屬于一個單倍群。Y 染色體單倍群具有人群和地理區(qū)域差異，在人類學(xué)的背景下，可推斷未知樣本的種族或地理來源[5-7]， 或人群進化、遷徙及相關(guān)歷史活動[8]， 可有效評估群體的遺傳結(jié)構(gòu)[9]。因此，本文采用SNapShot法對70例貴州滿族男性個體22個Y-SNP位點進行基因分型，探討世居貴州滿族人群的父系遺傳特征，報告如下。

1 材料和方法

1.1 樣本收集及 DNA 標(biāo)化

根據(jù)知情同意原則，從課題組已經(jīng)建立的貴州世居少數(shù)民族DNA樣本庫中，篩選出70例貴州滿族男性DNA樣本，入選標(biāo)準為3 代內(nèi)無族外通婚史，個體間無親緣關(guān)系。每份DNA樣本用Thermo ScientificTMNanoDrop Lite分光光度計定量后，取少量標(biāo)化為20 mg/L作為實驗的模板，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 Y染色體基因分型

1.2.1多重 PCR 擴增及提純 依照國際系譜遺傳協(xié)會(international society of genealogy,ISOGG)在網(wǎng)站 https://isogg.org/tree/index.html上發(fā)布的Y單倍群系統(tǒng)進化樹，以其基本分支 C- O 及其亞簇為主, 篩選出 M145、RPS4Y711、M89、M9、M214、M175、M119、P31、M95、SRY465、47Z、M122、M324、P201、M159、M7、M134、M133、M217、M48、M407、P53.1共22個Y-SNP 為研究靶點，參考文獻[10]分成 4 組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)進行 PCR 擴增(引物序列及分組情況見表 1)。體系包括20 mg/L的模板DNA 1.5 μL、引物 MIX 15 μL、10 nmol/L dNTP 3.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、Taq DNA 聚合酶0.5 μL、1 mmol/L甜菜堿 1.0 μL(其作用表現(xiàn)為富含 GC 模板的PCR擴增和提高 Taq DNA 聚合酶的穩(wěn)定性)、5 mmol/L MgCl21.0 μL、500 mg/L 牛血清蛋白(BSA)0.5 μL。循環(huán)條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，循環(huán) 35 次；72 ℃ 7 min，產(chǎn)物置4 ℃保存。純化：第Ⅰ、Ⅱ組PCR 產(chǎn)物各取1 μL混合，加入1 000 U/L蝦堿酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)1 μL和1 000 U/L大腸桿菌核酸外切酶Ⅰ(exonuclease,ExoⅠ)1 μL，37 ℃ 70 min后75 ℃ 15 min，即得純化后的多重 PCR產(chǎn)物，4 ℃保存，充當(dāng)單堿基擴增時A組的模板。第Ⅲ、Ⅳ組擴增產(chǎn)物也如法純化，充當(dāng)單堿基擴增時 B 組的模板。

1.2.2SNapShot 單堿基擴增及純化 分A、B兩組進行單堿基擴增(分組情況及引物信息見表2)。體系包括模板 0.75 μL、SNapShot Mix 1.25 μL、單堿基擴增引物 MIX 0.5 μL。循環(huán)條件為96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán) 28 次，產(chǎn)物4 ℃保存。純化：單堿基擴增產(chǎn)物加入1 000 U/L的SAP0.5 μL，混勻，瞬時離心，37 ℃ 70 min后75 ℃ 15 min滅活酶，即得純化后的 SNapShot 單堿基延伸產(chǎn)物，4 ℃保存。

1.2.3ABI 3130 毛細管電泳檢測 純化的單堿基延伸產(chǎn)物0.5 μL、GeneScan-120LIZ Size Standard 0.05 μL 和 Hi-DiTM甲酰胺 9.45 μL，混勻、離心并用ABI 3130遺傳分析儀(applied biosystems)進行毛細管電泳分析，ABI 3130 Genetic Analyzer Data Collection Software v3.0 進行數(shù)據(jù)收集。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用直接計數(shù)法計算22個Y-SNP等位基因頻率、單倍型頻率與單倍群頻率。單倍型多樣性(HD)和基因多樣性(genetic diversity，GD)根據(jù)公式HD或GD=n(1-ΣPi2)/(n-1)(Pi為單倍型頻率或單倍型頻率，n為樣本數(shù))計算。運用 SPSS 24 軟件進行主成分分析(principle component analysis, PCA)，根據(jù)單倍群頻率用 Arlequin3.5軟件計算13個群體的遺傳距離Fst值，MEGA 7.0軟件根據(jù)Fst值用Neighbor-Joining法繪制系統(tǒng)進化樹。

表1 篩選出的22個Y-SNP位點的多重PCR引物和SNapShot單堿基擴增引物Tab.1 The sequences of Multiplex PCR primers and SNapShot microsequencing primers for 22 SNPs on Y-chromosome

2 結(jié)果

2.1 貴州滿族人群22個Y-SNP的遺傳多態(tài)性

采用SNapShot法對貴州滿族人群22個Y-SNP位點進行復(fù)合擴增檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所分析的22個Y-SNP位點中，P53.1位點較為特殊、測出結(jié)果均為C/T相同雙峰，無多態(tài)性，因此僅納入其它的21個Y-SNP位點進行分析，通過直接計數(shù)法獲得其它的21個Y-SNP位點等位基因頻率(圖1)、基因多樣性(圖2)和單倍型頻率(表2)，分析發(fā)現(xiàn)除了47Z、RPS4Y711、SRY465、M407、M159、M7、M217、M48位點沒有多態(tài)性(GD=0.000 0)，其余13個SNP 位點均具有遺傳多態(tài)性，Y-SNP突變頻率為0.014 3～0.971 4、GD值為 0.028 6～0.492 3。22個Y-SNP位點單倍型共檢出11種(其中有3個單倍型是唯一單倍型)，頻率為0.014 3～0.371 4，HD值為0.740 4。依照國際系譜遺傳(international society of genealogy,ISOG)網(wǎng)站https://isogg.org/tree/index. html 上發(fā)布的Y單倍群系統(tǒng)進化樹進行單倍群的劃分，通過直接計數(shù)法獲得單倍群頻率(見表3第1行)其中單倍群O*頻率高達0.942 4。

圖1 貴州滿族人群21個Y-SNP的基因頻率Fig.1 The frequencies of 21 Y-SNPs loci in Manchu population from Guizhou

圖2 貴州滿族人群21個Y-SNP的基因多樣性Fig.2 Genetic diversity values of 21 Y-SNPs loci in Manchu population from Guizhou

表2 貴州滿族人群21個Y-SNP組成的11種單倍型頻率分布(n=70)Tab.2 11 haplotype frequency distribution of the 21 Y-SNPs loci in Manchu Population from Guizhou

2.2 貴州滿族與12個少數(shù)民族的群體遺傳學(xué)分析

2.2.1貴州滿族與12個少數(shù)民族的主成分分析 將本次研究結(jié)果與已有文獻報道的12個中國少數(shù)民族人群的單倍群頻率進行比較(表3)，運用SPSS 24軟件進行主成分分析(圖3)，在主成分分析三維圖上可以看到壯侗語族(水族、布依族、仫佬族)聚為一簇，苗瑤語族(畬族、苗族、瑤族)聚為一簇、滿-通古斯語族(錫伯族、鄂倫春族、遼寧滿族)與突厥語族(維吾爾、柯爾克孜族、哈薩克族)聚為一簇，而本研究的貴州滿族單獨為一簇。

2.2.2貴族滿族與12個少數(shù)民族的系統(tǒng)進化樹 貴州滿族和中國12個少數(shù)民族人群間的Fst值分布情況見表4。基于13個人群單倍群分布頻率用 Arlequin 3.5軟件計算出群體間的遺傳距離Fst值，結(jié)果顯示13個群體間的Fst值為0.031 3～0.691 1，貴州滿族與其他群體的Fst值介于0.162 8～0.497 2，其中貴州滿族與新疆錫伯之間的遺傳距離最小(0.162 8)，與內(nèi)蒙鄂倫春族之間的遺傳距離最大(0.497 2)，根據(jù) 13 個群體之間的遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹見圖4。

圖3 貴州滿族和中國12個少數(shù)民族人群Y染色體主成分分析Fig.3 The principal component analysis of Y chromosome of Guizhou Manchu and 12 ethnic minority populations in China

表3 貴州滿族和中國12個少數(shù)民族Y染色體單倍群頻率Tab.3 Y-SNP haplotype frequencies of Manchu in Guizhou and 12 ethnic minority populations in China

表4 貴州滿族和中國12個少數(shù)民族人群間的Fst值 Tab.4 Fst values of Guizhou Manchu and 12 ethnic minority populations in China

注：“+”為P<0.05，“-”為P≥0.05；對稱軸上對應(yīng)的P值，對稱軸下是Fst值

圖4 用鄰接方法(NJ)構(gòu)建的貴州滿族和中國12個少數(shù)民族人群系統(tǒng)進化樹Fig.4 The phylogenetic tree of Guizhou Manchu and 12 ethnic minority groups in China

3 討論

為了探討遷入并世居貴州的滿族人群的父系遺傳特征，本研究選擇了Y染色體非編碼區(qū)的22個Y-SNP 位點作為靶點，對70例貴州滿族無關(guān)男性個體進行基因分型，并對結(jié)果進行相關(guān)統(tǒng)計分析。基因多樣性分析結(jié)果顯示，22個 Y-SNP位點中，P53.1位點測出結(jié)果均為雙峰，可能是由于該位點所在片段在其他基因片段中有重復(fù)片段，Hueles等[13]在報道中稱兩峰現(xiàn)象是由于第一次擴增時產(chǎn)生了兩種不同的擴增產(chǎn)物，而杜宏等[14]人推測該位點是被檢測人群中的序列差異而出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，究其原因還需進行進一步研究，其他21個Y-SNP位點均得到較好的分型結(jié)果，47Z、RPS4Y711、SRY465、M407、M159、M7、M217、P53.1、M48等9個Y-SNP 位點無多態(tài)性(GD=0.000 0)，具有遺傳多態(tài)性的13個Y-SNP 位點的突變頻率為 0.014 3～0.971 4，GD值為 0.028 6～0.492 3。21個Y-SNP位點所組成的單倍型共檢出11種，頻率為 0.014 3～0.371 4，HD 值為 0.740 4，可以看出 GD值和HD值都很低。影響群體遺傳結(jié)構(gòu)的因素有很多，包括人群的遷徙、自然環(huán)境、地理的隔離。提示貴州滿族遷入貴州時人群數(shù)量有限，經(jīng)過長期的遷移后到達新的領(lǐng)域適應(yīng)新環(huán)境時容易發(fā)生遺傳漂變，遵循適者生存原則，經(jīng)過長時間的積累會出現(xiàn)奠基者效應(yīng)。同時，由于貴州境內(nèi)山巒起伏，地貌類型復(fù)雜，交通不便，相對封閉，與外界很少交流，導(dǎo)致Y-SNP的遺傳多樣性比原始民族低很多，因此可能出現(xiàn)瓶頸效應(yīng)，導(dǎo)致貴州滿族人群的GD值和HD值都很低。接下來對其進行單倍群相關(guān)性分析，O2a2b1與NO1(R=0.826，P=0.001)、O1a(R=0.723，P=0.005)、O1b(R=0.826，P=0.001)、O2a (R=0.826，P=0.001)為顯著正相關(guān)。在本研究的貴州滿族70個男性個體中，單倍群O*頻率高達0.942 4，符合單倍群O*在中國人群中呈高頻分布[15]。

為了說明貴州滿族與其他民族間的關(guān)系，本研究選取了已有報道的中國不同語族的12個少數(shù)民族與貴州滿族的單倍群頻率進行主成分分析。在主成分分析三維圖上可以看到壯侗語族(水族、布依族、仫佬族)聚為一簇，苗瑤語族(畬族、苗族、瑤族)聚為一簇、滿-通古斯語族(錫伯族、鄂倫春族、遼寧滿族)與突厥語族(維吾爾、柯爾克孜族、哈薩克族)聚為一簇，而本研究的貴州滿族單獨為一簇。從語言學(xué)上分類，貴州滿族屬于滿-通古斯語族，從地理分布上來看，貴州滿族已世居南方(貴州省)；但在主成分分析中，該人群既不與滿-通古斯語族民族聚在一起，又不與貴州其他民族聚在一起，提示可能貴州滿族從其起源地開始逐漸向外遷徙的同時，不斷地與其他民族發(fā)生基因交流，進入貴州之后因為時間、語言、地理等原因雖與貴州其他少數(shù)民族發(fā)生基因交融，但仍然一定程度保留了本民族的基因特點，形成了獨特的遺傳結(jié)構(gòu)。課題組前期對9個人群線粒體 DNA 的單倍群頻率進行主成分分析顯示，貴州滿族與南方民族聚為一簇，母系和父系遺傳標(biāo)記得到結(jié)果并不一致[16]。推測從北方遷徙到貴州的滿族可能主要是通過與當(dāng)?shù)仄渌褡宓呐酝ɑ椋优畡t主要隨父親保留了滿族的族源，從而形成了貴州滿族人群在母系遺傳上與當(dāng)?shù)孛褡灏l(fā)生了基因交融、而父系遺傳結(jié)構(gòu)則較大程度的保留了北方滿族特性的群體遺傳學(xué)特征。

根據(jù)13個人群單倍群計算出群體間的遺傳距離Fst值，由遺傳距離矩陣繪制遺傳進化樹。遺傳距離矩陣顯示貴州滿族與其他少數(shù)民族均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，13個群體之間的Fst在0.031 3～0.691 1，貴州滿族與其他群體的Fst值介于0.162 8～0.497 2，其中貴州滿族與新疆錫伯族之間的遺傳距離最小(0.162 8)，提示貴州滿族與新疆錫伯族親緣關(guān)系較近，這與百茹峰等[17]選擇11個Y-STR基因座對24個群體的分子遺傳學(xué)關(guān)系進行分析顯示滿族與錫伯族的遺傳距離最小(0.012 4)的結(jié)果一致。在進化樹的分析中壯侗語族聚為一支，然后與苗瑤語族聚為一大支，滿-通古斯語族與突厥語族聚為一大支，貴州滿族與新疆錫伯族聚為一支，進化樹分析和主成分分析結(jié)果基本一致。

綜上所述，從父系遺傳結(jié)構(gòu)分析，貴州滿族既固有北方民族特點，又受到其他族群的影響，形成了父系獨特的遺傳特點，這與滿族復(fù)雜的民族演化進程相符。