貴州土家族16個Y-SNP多態性研究*

張秀秀， 喻艷琴， 田 薇， 李 鳴， 王嬋娟， 張 婷， 單可人， 朱衛芳， 何 燕*

(1.貴州醫科大學 地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 貴州省醫學分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 3.宿遷子淵司法鑒定所， 江蘇 宿遷 223800)

Y染色體具有遺傳非重組和直接由父到子傳遞的獨特特征，子代只能在父輩突變的基礎上發生新突變，而不會丟失祖先的突變特征[1]，是重建男性譜系的有用標記，因此廣泛用于人類學、法醫學和遺傳學等領域[2-5]。Y染色體上16個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP) 在人口和地理區域中非隨機分布，能夠推斷個體的種族來源[6]或地理來源[7]，在人類學的背景下，可推斷人群進化、遷徙及相關歷史活動，能夠有效地評估群體的遺傳結構[8]。自 1957 年土家族被正式確認為單一民族[9]后，對于土家族的研究才從真正意義上開。土家族屬于漢藏語系藏緬語族，土家族的源流問題存在各種假說，比如巴人說、僰人說[10]、土著說、江西說、烏蠻說、氐羌說等[11]， 但大部分支持巴人學說[12-13]。本課題對貴州土家族人群16個Y-SNP 位點進行多態性研究，以期獲得貴州土家族人群16個Y-SNP 位點等位基因頻率、單倍型頻率與單倍群頻率頻率分布情況，并與南方8個少數民族群體進行探討，從父系遺傳的角度為貴州土家族的起源提供遺傳學證據。

1 材料和方法

1.1 樣本收集及 DNA 標化

從課題組建立的貴州世居少數民族DNA樣本庫中，根據知情同意原則，篩選出68例無族外通婚史、3 代內無親緣關系的貴州土家族健康男性樣本。每份DNA樣本用分光光度法(NanoDrop-Lite)標化為20 mg/L后， -40 ℃保存備用。

1.2 Y染色體基因分型

1.2.116個Y-SNP位點多重PCR擴增及純化 依照國際遺傳譜系學會(international society of genetic genealogy,ISOGG)在網站 https://isogg.org/tree/index.html 上發布的Y單倍群系統進化樹，以其基本分支C-O及其亞簇為主, 篩選出M145、RPS4Y711、M89、M9、M175、M119、M95、SRY465、M122、M324、M159、M7、M134、M217、M48及M407共16個Y-SNP為研究靶點，參考文獻[14]分成4組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)，按照不同的濃度比例混合各組引物進行多重PCR擴增(濃度、用量、分組情況及引物信息見表1)。PCR擴增體系為25 μL，其中包括20 mg/L的模板DNA 1.5 μL、引物MIX 15 μL、10 nmol/L、dNTP 3.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、Taq DNA 聚合酶0.5 μL、1 mmol/L甜菜堿1.0 μL(其作用在于富含GC模板的PCR擴增和提高Taq DNA聚合酶的穩定性)、5 mmol/L MgCl21.0 μL、500 μg/mL牛血清蛋白(BSA)0.5 μL。循環條件：95 ℃ 10 min； 95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，循環 35 次；72 ℃ 7 min，產物4 ℃保存。純化：第Ⅰ、Ⅱ組PCR產物各取 1 μL 混合、加入 1 000 U/L蝦堿酶 (shrimp alkaline phosphatase,SAP)1 μL 和 1 U/μL大腸桿菌核酸外切酶Ⅰ(exonucleaseⅠ,ExoⅠ)1 μL 進行純化處理以去除多余的引物和dNTP，37 ℃ 70 min 、75 ℃15 min滅活酶，純化后的多重PCR產物于4 ℃保存、充當單堿基延伸時A組的模板；第Ⅲ、Ⅳ組PCR產物也如法純化，充當單堿基延伸時 B 組的模板。

1.2.2SNapShot 單堿基延伸及純化 單堿基延伸引物：單堿基延伸引物其3′ 端對應待測Y-SNP位點的前一個堿基，確保PCR擴增延伸的第一個堿基即對應待測SNP位點；單引物的5′端則加入不同長度的核苷酸(不與基因組任何地方配對)進行修飾，使得不同 SNP 位點對應的單引物的長度不同，有利于根據大小區分不同Y-SNP位點的擴增產物。按照不同的濃度比例混合各組單堿基延伸引物，分A、B兩組進行復合引物單堿基延伸反應(濃度、用量、分組情況及引物信息見表2)。使用SNaPshot試劑盒(ABI, 美國)進行單堿基延伸反應，體系包括經ExoⅠ和SAP純化后PCR產物0.75 μL、SNapShot Mix 1.25 μL、單堿基擴增引物MIX 0.5 μL，循環條件為96 ℃ 10 s、50 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s循環28次，產物4 ℃保存。純化：單堿基擴增產物加入1 000 U/L的SAP0.5 μL，混勻、瞬時離心，37 ℃保溫70 min 后75 ℃ 15 min滅活酶，即得純化后的SNapShot單堿基延伸產物，4 ℃保存。

表1 篩選出的16個Y-SNP位點的多重 PCR 引物信息和分組Tab.1 Multiplex PCR primer sequences for 16 Y-SNP loci

表2 16個Y-SNP位點的SNapShot單堿基擴增引物和分組Tab.2 The primer sequences for Single base amplification of 16 Y-SNPs using SNapSHot kit

注：F為上游引物，R為下游引物

1.2.3ABI 3130 毛細管電泳檢測 純化的單堿基延伸產物0.5 μL、GeneScan-120LIZ Size Standard 0.05 μL和Hi-DiTM甲酰胺9.45 μL，混勻后上樣于ABI 3130遺傳分析儀進行毛細管電泳分析，ABI 3130 Genetic Analyzer Data Collection Software v 3.0 進行數據收集。

1.3 數據分析

用直接計數法計算16個Y-SNP位點等位基因頻率、單倍型頻率以及單倍群頻率，單倍型多樣性(haplotype diversity, HD)值和基因多樣性(gene diversity，GD)值根據公式 HD/GD=n(1-ΣPi2)/(n-1)計算(Pi為單倍型頻率或等位基因頻率，n為樣本數)。將貴州土家族的單倍群分布頻率與已報道的國內8個少數民族群體進行比較分析，采用IBM SPSS Statistics 24軟件進行主成分分析(principle component analysis, PCA)，依據各群體“主成分1、2、3”,使用Surfer 12.0軟件繪制出等值線圖。

2 結果

2.1 Snapshot 分型結果

采用SNapShot法對貴州土家族68份樣本16個Y-SNP位點進行基因分型，等位基因頻率和GD值見表3 ，單倍型頻率結果見表4，所分析的16個Y-SNP位點中，M48、M407、M119、SRY465、M159突變頻率均為0，無基因多樣性(GD=0)，其余11個Y-SNP位點均具有遺傳多態性，GD值的范圍為0.029～0.497。16個Y-SNP位點的共檢測出11種單倍型，其中頻率最低為0.015， 最高為0.338；組成單倍型的Y-SNP的順序為RPS4Y711、M217、M48、M407、M145、M89、M9、M175、M119、M95、SRY465、M122、M324、M159、M7、M134，經計算HD值為0.792。

表3 貴州土家族人群16個Y-SNP的基因頻率和GDTab.3 GD values and frequencies of 16 Y-SNPs loci in Guizhou Tujia population

表4 貴州土家族人群16個Y-SNP組成的11種單倍型頻率分布(n=68)Tab.4 11 haplotype frequency distributions in the 16 Y-SNPs loci of Tujia population

2.2 貴州土家族與南方8個少數民族的群體遺傳學分析

依照國際遺傳譜系學會(ISOGG)在網站 https://isogg.org/tree/index.html上發布的Y單倍群系統進化樹進行單倍群劃分，通過Excel繪制貴州土家族與南方8個少數民族Y染色體單倍群頻率熱圖(見表5)，對9個少數民族在不同位點的分布情況進行直觀觀測，綠色→黃色→紅色單倍群頻率逐漸增加。

表5 貴州土家族和其他民族Y染色體單倍群頻率
Tab.5 Y-SNP haplotype frequencies of Guizhou Tujia and eight minority populations in Southern China

2.2.1貴族土家族與南方8個少數民族的PCA 貴州土家族與已有文獻報道的8個人群單倍群(見表5)進行PCA(見圖1)，前3個成分解釋了67.808%的總方差。在PCA三維圖上可以看到貴州土家族與湖南土家族、云南彝族、云南景頗族、云南漢族聚為1簇，廣西仫佬族與貴州水族聚為1簇，云南佤族與云南納西族聚為1簇。

圖1 貴州土家族與南方8個民族Y染色體單倍群PCA二維圖 Fig.1 The principal component analysis of Y chromosome of Guizhou Tujia population and eight minority populations in Southern China

2.2.2貴州土家族與南方其他8個少數民族前3個主成分在等值線圖上的分布 根據各個群體單倍群分布頻率PCA分析結果中，提取主成分1、2、3作為依據指標(見表6)，采用 Surfer 12繪制出等值線圖(圖 2、3、4)。通過等值線圖，可以較清晰顯示分布在不同地域人群在發展過程中相互間的關系。主成分 1 等值線圖(圖2)貢獻率為 29.281%，可以看成是幾個民族的相互作用，從等值線顏色上觀察，貴州土家族受到的影響最小。主成分2等值線圖(圖 3)貢獻率為24.173%，出現2個高峰值，一個是以云南彝族為中心，另一個是以湖南土家族為中心，可以看成是湖南土家族與云南彝族的擴張，在主成分2等值線顏色上看，貴州土家族受到了一定的影響，在云南納西族聚居的地方有所減弱，對貴州水族與廣西仫佬族的影響最弱。主成分3等值線圖(圖4)貢獻率為14.353%，可以理解為貴州土家族與貴州水族、湖南土家族之間的相互影響，從顏色上看，貴州土家族對貴州水族、湖南土家族的影響大于他們對貴州土家族影響。

3 討論

本研究選擇了Y染色體16個SNP位點作為靶點，對68例貴州土家族男性個體進行基因分型，并對結果進行相關統計分析。等位基因頻率、GD值見表2、 單倍型頻率見表3， GD值的范圍為 0.029～0.497，HD值為0.792，GD值和HD值均較低，說明該人群曾出現過較長時間的建立者效應和瓶頸期，出現這種現象的原因可能是長期的戰亂導致人口多次急劇下降，例如公元前11世紀，巴人參加武王伐紂戰爭[21]，春秋戰國時期，巴楚相爭，公元前661 年，巴人滅庸[22]，公元前223年秦滅巴國[23]后，其少數后裔進入貴州，在大山的阻隔下，減少了種群間的基因交流，使得遺傳多樣性非常低。通過 Excel 繪制貴州土家族與南方8個少數民族Y染色體單倍群頻率熱圖對各民族在不同位點的分布情況進行直觀觀測：(1)9個南方群體中，幾乎沒有遺傳結構相似的群體，體現了南方民族內部遺傳結構的多樣性；(2)貴州土家族在單倍群C*(0.368)和單倍群 O(0.324)具有高頻分布，提示貴州土家族的起源并不單一。ZERJAL 等[24]提出單倍群C*是隨著蒙古人的擴張將成吉思汗或者其親屬的Y染色體傳到中亞，發展至今在中亞，蒙古和中國北方的部分地區有大約8%的男性為該譜系的Y染色體，C*單倍群在北方的頻率高于南方，而本研究貴州土家族C*(0.368)具有高頻分布，提示貴州土家族可能與北方民族發生過基因交融；經計算貴州土家族單倍群O*的分布頻率為0.588，與文獻報道南方民族群體的單倍群 O*頻率分布較高相符[25- 26]。

表6 9個群體的經緯度分布及相應的PCA前2主成分值Tab.6 Latitude and longitude of 9 populations and their PCA components

注:PC1、PC2、PC3表示 PCA 中提取信息量最高的主成分1、2、3

注：1～9對應表6中民族地區及經緯度位置圖2 主成分1在等值線圖上的分布Fig.2 The distribution of PCA component 1 on contour map

注：1～9對應表6民族地區及經緯度位置圖3 主成分2在等值線圖上的分布Fig.3 The distribution of PCA component 2 on contour map

注：1～9對應表6民族地區及經緯度位置圖4 主成分3在等值線圖上的分布Fig.4 The distribution of PCA component 3 on contour map

為了探討貴州土家族與南方其他少數民族間的關系，本研究選取了已有報道的中國南方 8個少數民族與貴州土家族的單倍群頻率進行PCA。在主成分三維圖上貴州土家族與湖南土家族、云南彝族、云南景頗族、云南漢族為一簇；廣西仫佬族與貴州水族聚為一簇；云南佤族與云南納西族聚為一簇。有趣的是云南納西族與貴州土家族同為藏緬語族彝語支卻沒有聚在一起，這與謝選華等[27]對土家族源流的遺傳學初探結果相符，提示云南納西族與其他群體的分離時間較早。

依據PCA的3個主要成分作為指標，采用Surfer 12繪制出等值線圖，結果顯示，主成分 1 等值線圖(圖2)貢獻率為 29.281%，可以看成是幾個民族的相互作用，從等值線顏色上觀察，貴州土家族受到的影響最小，可能是因為貴州土家族居住地多在山區，較少與外民族交流，提示貴州土家族保留了其獨特的父系遺傳結構；主成分2等值線圖(圖 3)貢獻率為24.173%，出現2個高峰值，一個是以云南彝族為中心，另一個是以湖南土家族為中心，可以看成是湖南土家族與云南彝族的擴張，在主成分2等值線顏色上看，貴州土家族受到了一定的影響，在云南納西族聚居的地方有所減弱，對貴州水族與廣西仫佬族的影響最弱，提示貴州土家族與湖南土家族、云南彝族可能發生了基因交流；主成分3等值線圖(圖4)貢獻率為14.353%，可以理解為貴州土家族與貴州水族、湖南土家族之間的相互影響，從顏色上看，貴州土家族對貴州水族、湖南土家族的影響大于他們對貴州土家族影響。從等值線坡度上看湖南土家族對貴州土家族的影響較大，可能是貴州土家族的采樣地點(經緯度108.8°N 27.8°E)與湖南土家族的采樣地點(經緯度109.7°N 28.3°E)離的特別近的緣故。

綜上所述，本文通過對貴州土家族與中國南方的8個少數民族遺傳關系的探討，貴州土家族可能與湖南土家族、云南彝族、云南景頗族、云南漢族、貴州水族發生了基因交融，但又保留了其大部分獨特的父系遺傳特征。