胃康3號對功能性消化不良小鼠胃竇、十二指腸及腦組織NT、CGRP受體表達的影響

肖政華，譚芊任，崔峻松

(1 貴陽中醫學院第二臨床醫學院，貴陽550002；2 貴陽中醫學院第二附屬醫院)

基金項目：貴州省科學技術基金項目(黔科合J字[2012]2068號)。

功能性消化不良(FD)是指由多種因素引起的具有慢性消化不良癥狀，但不能用器質性、系統性或代謝性疾病等來解釋的消化系統疾病[1]。FD的病因和發病機制還不十分清楚，以往多考慮與胃腸動力障礙、內臟高敏感性、社會心理等因素有關[2,3]。目前一致認為，腦腸軸異常是FD發病的根源。腦腸肽，如神經降壓素(NT)、降鈣素基因相關肽(CGRP)等，是腦腸軸雙向交通通路的分子基礎。腦腸軸異常時，腦腸肽分泌失調，繼而導致胃腸運動功能紊亂和內臟敏感性增高。目前，西醫治療FD并無標準方案，主要采取抑制胃酸分泌、促進胃腸動力、根除幽門螺桿菌等對癥治療，雖然起效快、作用明顯，但長期或大量使用上述藥物，不良反應較多，且停藥后易復發[4]。FD屬中醫“胃脘痛”“痞滿”等范疇，常見證型為肝郁脾虛型。中醫治療FD起效雖然不如西醫迅捷，但療效穩定，不良反應少，復發率較低[5～8]。胃康3號是貴州省已故名老中醫陳慈煦教授行醫五十余載創立的臨床經驗方，也是貴陽中醫學院第二附屬醫院治療肝郁脾虛型“痞滿”“胃脘痛”的協定方，已用于臨床治療肝郁脾虛型FD多年，但對其作用機制尚不明確。本研究觀察了胃康3號對FD小鼠胃竇、十二指腸和腦組織NT、CGRP受體表達的影響，旨在從腦腸軸角度探討胃康3號治療FD的作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級、昆明種小鼠40只，雌雄各半，1月齡，體質量18～22 g，購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司，動物許可證號：SCXK-(軍)2012-0011。所有小鼠分籠飼養，每籠10只。動物房溫度18～22 ℃，濕度50%～60%，光照12 h明暗交替。實驗期間自由攝食、飲水。胃康3號，由四川新綠色藥業科技發展股份有限公司生產的智能顆粒組成，方藥組成：柴胡12 g、黨參12 g、白芍12 g、佛手9 g、延胡索6 g、川楝子9 g、丹參10 g、炒白術15 g、茯苓12 g、木香6 g、陳皮6 g、甘草4 g。由貴陽中醫學院第二附屬醫院智能中藥房將所有顆粒混合，加水，用恒溫水浴鍋濃縮至含生藥0.675 g/mL。多潘立酮，購自西安楊森制藥有限公司，規格10 mg/片，實驗前用蒸餾水配制成0.5 mg/mL藥液。RM2016型輪轉切片機，上海徠卡儀器有限公司；XSP-C204雙目生物顯微鏡，重慶重光實業有限公司；Image Pro Plus6.0圖像分析系統；電熱恒溫水浴箱，上海醫療器械七廠。兔抗小鼠CGRP單抗、兔抗小鼠NT單抗，北京博奧森生物技術有限公司；SP-9000免疫組化染色試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 動物分組處理 所有小鼠適應性喂養3 d，隨機抽取10只作為對照組，剩余小鼠參照文獻[9]并加以改進，制備不可預知的慢性應激模型。應激程序：①食物剝奪24 h；②明暗顛倒24 h；③飲水剝奪合并空瓶刺激12 h；④濕籠飼養24 h；⑤強迫游泳5 min(水溫45 ℃)；⑥倒懸30 min；⑦束縛30 min；⑧超聲波噪音2 h；⑨夾尾1 h。每天隨機選取任意一種應激項目，相鄰兩天選擇的項目不能相同，連續21 d。每天08：30更換應激項目，每種項目使用2～3次。當小鼠逐漸出現煩躁易怒、飲食下降、毛發枯槁、體質量減輕，小腸推進率下降，胃殘留率增加，同時出現血清GAS、MTL水平降低[10]，即FD模型制備成功。30只小鼠均制成FD模型，無死亡。隨機將FD模型小鼠分為模型組、多潘立酮組、胃康3號組，每組10只。制模第22天，參照文獻[11]，多潘立酮組給予0.5 mg/mL多潘立酮藥液7.56 mL/(kg·d)灌胃，胃康3號組給予含生藥0.675 g/mL胃康3號藥液7.56 mL/(kg·d)灌胃，模型組給予等量蒸餾水灌胃，連續灌胃7 d。對照組正常喂養，不建模。

1.3 胃竇、十二指腸及腦組織NT、CGRP受體表達檢測 采用免疫組化SP法。模型組、多潘立酮組、胃康3號組末次灌胃次日，對照組同日，用10%水合氯醛4.0 mL/kg麻醉，無菌條件下取出胃竇、十二指腸和腦組織。各組織用4%多聚甲醛固定1 h，依次放入15%、20%、30%蔗糖溶液沉底24 h。OTC包埋，18 μm厚連續切片。3% H2O2去離子水孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶活性；PBS沖洗3 min×3次，加入正常山羊血清100 μL，室溫孵育15 min；棄血清，分別加入兔抗小鼠NT或CGRP單抗(稀釋比均為1∶500)，37 ℃孵育2 h；PBS沖洗3 min×3次，加入SP-9000生物素化二抗100 μL，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗3 min×3次，加入辣根酶標記的鏈霉卵白素100 μL，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗3 min×3次，DAB染色10 min，雙蒸水終止染色，蘇木素復染1 min，貼片，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，水溶性封片劑封片，顯微鏡下觀察。用正常山羊血清和0.01 mmol/L PBS(pH 7.3)代替一抗作空白對照，以檢查免疫反應的特異性。結果判定標準：在胃竇、十二指腸組織中，NT、CGRP陽性染色定位于細胞膜和細胞質，呈棕色或棕黃色；在腦組織中，NT、CGRP陽性染色定位于神經元的細胞膜，呈棕色或棕黃色深染。每張切片隨機選取5個400倍不重疊視野，采用Image Pro Plus6.0圖像分析系統分析光密度值(胃竇、十二指腸組織)或陽性細胞數(腦組織)。以其光密度值或陽性細胞數作為NT、CGRP受體相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 各組胃竇組織NT、CGRP受體表達比較見表1。

表1 各組胃竇組織NT、CGRP受體相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

2.2 各組十二指腸組織NT、CGRP受體表達比較見表2。

表2 各組十二指腸組織NT、CGRP受體相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

2.3 各組腦組織NT、CGRP受體表達比較見表3。

表3 各組腦組織NT、CGRP受體相對表達量比較(個

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

3 討論

FD的病因和發病機制尚不完全清楚，以往多考慮與胃腸動力障礙、內臟高敏感性、社會心理因素等有關，目前認為腦腸軸異常是其發病的根源。胃腸動力障礙和內臟高敏感性是FD的重要病理生理學機制[1]，腦腸軸異常可導致胃腸道動力和感覺異常，對各種應激的運動反應增強和內臟的高敏感性。腦腸肽又稱胃腸激素，是一種小分子肽類活性物質，在胃腸和中樞神經系統雙重分布，主要分布在脊髓、延髓、下丘腦及胃腸道系統。腦腸肽是腦腸軸雙向交通通路的分子基礎，是連接和調控腦腸軸交互作用的樞紐，直接參與調節胃腸道的運動、感覺和分泌，并參與情緒的調控，具有神經遞質和激素雙重作用，是聯系認知感情中樞和神經內分泌、腸神經系統與免疫系統之間的雙向交通通路[12]。至今已發現腦腸肽60余種。

NT是一種重要的腦腸肽，廣泛分布于哺乳動物的腦和胃腸道中。生理濃度NT可抑制胃酸分泌，減少胃蠕動，延緩胃排空，對胃腸運動主要起抑制作用[13，14]。Bardella等[15]研究發現，消化不良者外周血NT水平明顯升高，從而產生腹痛、腹瀉等腸道激惹癥狀。CGRP亦是一種重要的腦腸肽，廣泛分布于中樞和外周神經系統，特別是感覺神經元胞體和末梢以及胃腸道壁內神經叢。CGRP在消化系統的生理病理機制中具有重要作用，可抑制胃酸分泌、減少胃腸蠕動、增加胃黏膜血流、調節其他胃腸激素分泌以及保護胃黏膜等作用。另外，無論是中樞還是外周CGRP的釋放均參與內臟敏感性變化[16]，而內臟高敏感性一直被認為是功能性胃腸道疾病的主要發病機制之一[17]。

FD屬中醫“胃脘痛”“痞滿”等范疇，常見證型為肝郁脾虛型。其病位在脾胃，但與肝脾密切相關。《素問·寶命全形論》就有“土得木而達”，強調了肝木對脾土的促進、疏通暢達作用。此外，“培土”可以“榮木”，只有脾胃功能正常，氣血生化有源，肝才有氣血濡養，肝血才有所藏。因此，中醫肝脾在生理上相互為用，在病理上互相影響。臨床常見因情志抑郁惱怒，肝失疏泄，氣機郁滯，導致脾失健運而出現肝脾不調，表現為納呆痞滿、腹脹腹痛、胸悶太息等。因此，中醫治療FD應以疏肝健脾、行氣和胃為原則。

胃康3號是貴州省已故名老中醫陳慈煦教授行醫五十余載創立的臨床經驗方，也是貴陽中醫學院第二附屬醫院治療肝郁脾虛型“痞滿”“胃脘痛”的協定方，已在臨床應用多年，對肝郁脾虛型FD療效較好。方中柴胡疏肝解郁，黨參健脾益氣，共為君藥；陳皮理氣開胃，木香、佛手、川楝行氣止痛、導滯和中，白術培補中焦，共為臣藥；白芍養血柔肝，丹參行血散瘀，延胡索活血散瘀，利氣止痛，茯苓滲濕健脾，兼防參術生熱，共為佐藥，甘草為使藥。諸藥合用，共奏疏肝理氣、健脾益胃、行氣止痛之功。但其對腦腸軸的影響尚不清楚。

本研究結果顯示，模型組胃竇、十二指腸、腦組織NT、CGRP受體相對表達量均明顯高于對照組，而多潘立酮組、胃康3號組胃竇、十二指腸、腦組織NT、CGRP受體相對表達量較模型組均明顯下調，且多潘立酮組與胃康3號組不同組織NT、CGRP受體相對表達量比較差異無統計學意義。結果表明，FD小鼠胃竇、十二指腸、腦組織NT、CGRP受體表達明顯升高，經多潘立酮或胃康3號治療，在胃腸功能恢復同時，NT、CGRP受體表達均明顯下調，且胃康3號與多潘立酮的效果相當。

綜上所述，胃康3號能下調FD小鼠胃竇、十二指腸、腦組織NT、CGRP受體表達，這可能是其治療FD的作用機制之一。今后我們將繼續深入研究，以明確胃康3號對其他腦腸肽有無影響，以進一步明確其對腦腸軸的影響。