紫草素對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

孟凡清，張輝，張歆杰，王東

(1 濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261053；2 山東省千佛山醫(yī)院)

在冠狀動脈血運(yùn)重建及各種心內(nèi)直視手術(shù)中，心肌均會經(jīng)歷缺血再灌注(I/R)過程。I/R會引起心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng)和能量代謝障礙等改變，繼而導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，即使恢復(fù)血運(yùn)，心肌細(xì)胞也難以避免發(fā)生凋亡或壞死，患者臨床表現(xiàn)為術(shù)后突發(fā)心律失常、心力衰竭等，嚴(yán)重者甚至死亡[1,2]。紫草屬于紫草科紫草屬，是一種藥用價(jià)值非常豐富的多年生草本植物。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，紫草具有活血、清熱、解毒、涼血等功效，主要用于治療血熱毒盛、溫?zé)岚哒睢峤Y(jié)便秘等[3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，紫草的主要藥用成分為紫草素，具有一定抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡等作用[4～6]。但其能否減輕心肌I/R損傷目前尚不清楚。2017年9月～2018年9月，我們觀察了紫草素在大鼠離體心肌I/R過程中對心肌的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠40只，SPF級，體質(zhì)量260～300 g，購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號：SYXK(魯)2013-0001。所有動物分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25 ℃、濕度50%～60%、光照12 h明暗交替。紫草素，純度≥99%，美國Adooq Bioscience公司。離體動物心臟灌流裝置，成都泰盟軟件有限公司；Epoch全波長酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；ChemiDocTMImaging System，美國Bio-Rad公司；光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)ELISA試劑盒，美國TSZ公司；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒，瑞士Roche公司；PI3K、Akt、β-actin一抗，美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物分組處理 所有SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為對照組、模型組及紫草素1、5、25 mg/L組，每組8只。各組2%戊巴比妥鈉55 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉完全后舌下靜脈注射普通肝素250 U/kg。注射完畢，經(jīng)雙側(cè)胸肋三角入路迅速取出心臟，通過離體動物心臟灌流裝置建立離體心臟灌注模型[7]。模型組灌注K-H液30 min，停灌20 min，再灌注K-H液45 min。紫草素1、5、25 mg/L組灌注K-H液20 min，分別再灌注含紫草素1、5、25 mg/L的K-H液10 min，停灌20 min，再灌注K-H液45 min。對照組持續(xù)灌注K-H液95 min。

1.3 指標(biāo)觀察

1.3.1 LDH、CK含量 模型組與紫草素1、5、25 mg/L組分別于停灌前10 min及再灌注20、40 min，對照組于同時間(即灌注20、70、90 min)，收集離體灌注心臟的冠脈流出液，4 ℃冰箱保存。按照LDH、CK ELISA試劑盒說明，采用Epoch全波長酶標(biāo)儀檢測冠脈流出液LDH、CK含量。

1.3.2 心肌變性壞死率、心肌細(xì)胞凋亡率 各組灌注結(jié)束，立即從灌流裝置上取下心臟，用預(yù)冷的PBS沖洗干凈，-20 ℃快速冷凍5 min，分離心室。①心肌變性壞死率檢測：橫向切取部分左、右心室肌，1～2 mm厚切片。將切片置于1% TTC溶液，37 ℃水浴鍋中避光染色30 min，10%甲醛固定24 h。TTC染色后，將切片置于藍(lán)色背景板上拍照，用Image J軟件分析圖像。采用面積求積法計(jì)算心肌變性壞死率。②心肌細(xì)胞凋亡率檢測：取各組部分心室肌組織，-80 ℃冷凍，超薄切片機(jī)切片。切片經(jīng)二甲苯浸洗、梯度乙醇水化、甲醛固定后，蛋白酶K室溫孵育15 min。將標(biāo)本置于TUNEL反應(yīng)混合液中，37 ℃避光反應(yīng)60 min；然后將標(biāo)本浸泡于POD反應(yīng)液中，37 ℃孵育30 min；最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下拍照觀察。每張切片隨機(jī)選取8個視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率。

1.3.3 MDA、SOD含量和GSH/GSSG 取各組部分心室肌組織，用組織勻漿器將待檢標(biāo)本制成10%組織勻漿。按MDA、SOD、GSH/GSSG ELISA試劑盒說明，采用Epoch全波長酶標(biāo)儀檢測心室肌組織MDA、SOD含量和GSH/GSSG。

1.3.4 心肌組織PI3K、Akt蛋白表達(dá) 取對照組、模型組及紫草素25 mg/L組心室肌組織各50 mg，RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA法蛋白定量合格，加入5×loading buffer 75 μL，100 ℃水浴使蛋白充分變性。取適量變性蛋白，行SDS-PAGE。電泳至溴酚藍(lán)剛跑出分離膠時結(jié)束，然后將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，分別加入PI3K一抗(稀釋比1∶500)、Akt一抗(稀釋比1∶500)、β-actin一抗(稀釋比1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h。ECL發(fā)光，暗室中曝光、顯影。ChemiDocTMImaging System掃描圖像，Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間冠脈流出液LDH、CK含量比較 見表1。

表1 各組不同時間冠脈流出液LDH、CK含量比較

注：與對照組同期比較，*P<0.05 ；與模型組同期比較，#P<0.05 ；與紫草素1 mg/L組同期比較，△P<0.05；與紫草素5 mg/L組同期比較，▽P<0.05。

2.2 各組心肌變性壞死率、心肌細(xì)胞凋亡率比較 見表2。

2.3 各組心肌組織SOD、MDA含量及GSH/GSSG比較 見表3。

表2 各組心肌變性壞死率、心肌細(xì)胞凋亡率比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05 ；與紫草素1 mg/L組比較，△P<0.05；與紫草素5 mg/L組比較，▽P<0.05。

表3 各組心肌組織SOD、MDA含量及GSH/GSSG比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05； 與紫草素1 mg/L組比較，△P<0.05；與紫草素5 mg/L組比較，▽P<0.05。2.4 各組心肌組織PI3K、Akt蛋白表達(dá)比較 見表4。

表4 各組心肌組織PI3K、Akt蛋白相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

心肌細(xì)胞正常代謝過程中ROS產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)心肌I/R后，可引起心肌細(xì)胞代謝紊亂，產(chǎn)生大量ROS[8,9]，超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)ROS異常蓄積。ROS是一種強(qiáng)氧化劑，能夠破壞細(xì)胞膜完整性，使功能蛋白質(zhì)和DNA降解，嚴(yán)重時引起細(xì)胞凋亡[10～13]。在心肌I/R過程中，線粒體會釋放大量凋亡因子，造成心肌細(xì)胞凋亡增多。心肌細(xì)胞內(nèi)ROS異常沉積或心肌細(xì)胞凋亡增多均會引起心肌組織損傷，導(dǎo)致患者術(shù)后心律失常、心力衰竭等并發(fā)癥，繼而影響患者預(yù)后和生活質(zhì)量。

紫草素是從傳統(tǒng)中藥紫草中提取的一類萘醌類化合物。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，紫草素具有抗氧化、抗凋亡、抗感染等藥理作用，且在實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)[5,6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，具有抗氧化作用的藥物能夠減輕心肌I/R損傷[10，12]。但紫草素能否減輕I/R引起的心肌損傷尚不清楚。

CK、LDH及羥丁酸脫氫酶等心肌細(xì)胞內(nèi)的酶類物質(zhì)統(tǒng)稱為心肌酶，對維持心肌細(xì)胞正常代謝功能具有重要作用。由于心肌細(xì)胞膜具有選擇通透性，生理情況下只有極少量心肌酶能夠穿過細(xì)胞膜，因此血液中心肌酶含量較低。心肌細(xì)胞損傷可導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變，大量心肌酶得以釋放入血，血液中心肌酶含量明顯升高，并且其含量與心肌損傷程度具有較好的相關(guān)性。故可通過檢測血液中心肌酶含量來評估心肌損傷程度。本研究結(jié)果顯示，停灌前10 min，各組冠脈流出液CK、LDH含量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明本次建立的離體灌注模型穩(wěn)定；再灌后20、40 min，模型組、各紫草素組冠脈流出液CK、LDH含量較對照組同期明顯升高，即大鼠心肌出現(xiàn)了I/R損傷，證實(shí)大鼠離體心肌I/R損傷模型建立成功；再灌后20、40 min，紫草素5、25 mg/L組冠脈流出液CK、LDH含量較模型組同期明顯下降，而紫草素1 mg/L組與模型組同期比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明5、25 mg/L紫草素能夠減輕大鼠離體心肌I/R損傷，而1 mg/L紫草素的作用效果不明顯。本研究還發(fā)現(xiàn)，除再灌后40 min冠脈流出液CK含量外，紫草素25 mg/L組冠脈流出液CK、LDH含量均低于紫草素5 mg/L組同期，說明25 mg/L紫草素的心肌保護(hù)作用效果更好。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組和各紫草素組心肌變性壞死率、心肌細(xì)胞凋亡率均有不同程度升高，即心肌I/R可引起心肌細(xì)胞不同程度損傷。與模型組比較，各紫草素組心肌變性壞死率、心肌細(xì)胞凋亡率均有不同程度下降，且以紫草素25 mg/L組效果最明顯，說明1、5、25 mg/L紫草素均能減輕I/R引起的心肌變性壞死和心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組和各紫草素組心肌組織MDA含量均明顯增加，SOD含量、GSH/GSSG均明顯下降，說明I/R可引起大鼠心肌細(xì)胞氧化損傷。與模型組比較，紫草素5、25 mg/L組心肌組織MDA含量明顯下降，SOD含量、GSH/GSSG明顯升高，而紫草素1 mg/L組上述指標(biāo)變化不明顯，表明5、25 mg/L紫草素均能減輕I/R引起的心肌氧化損傷，而1 mg/L紫草素的作用效果不明顯。本研究還發(fā)現(xiàn)，紫草素25 mg/L組抗心肌氧化損傷的效果優(yōu)于紫草素5 mg/L組。

目前認(rèn)為，PI3K/Akt信號通路激活能夠減輕I/R損傷引起的細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與抑制Caspase活性、參與調(diào)解NF-κB作用以及抑制線粒體釋放凋亡因子等有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路還能通過激活一氧化氮合酶來減輕I/R所致的氧化損傷[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組心肌組織PI3K、Akt蛋白相對表達(dá)量均明顯降低，表明心肌I/R能抑制PI3K/Akt信號通路激活。與模型組比較，紫草素25 mg/L組心肌組織PI3K、Akt蛋白相對表達(dá)量均明顯升高，表明25 mg/L 紫草素預(yù)處理能夠逆轉(zhuǎn)心肌I/R對PI3K/Akt信號通路激活的抑制作用。

綜上所述，紫草素能夠減輕大鼠離體心肌I/R損傷，其作用機(jī)制可能與激活PI3K/Akt信號通路有關(guān)。