左乙拉西坦對(duì)難治性癲癇患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞MDR1 mRNA和P-gp表達(dá)的影響

張林，孫明霞，馬靜波，王健彪，華穎

(無(wú)錫市兒童醫(yī)院，江蘇無(wú)錫214000)

癲癇是兒童時(shí)期常見的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致不同程度的不可逆性腦損傷，并可遺留記憶減退、學(xué)習(xí)困難、精神障礙等。大部分患兒的癲癇發(fā)作經(jīng)正規(guī)抗癲癇藥物治療可得到控制，但20%～30%患兒對(duì)抗癲癇藥物反應(yīng)較差，癲癇發(fā)作難以控制，這部分癲癇被稱為難治性癲癇[1]。難治性癲癇最突出的特征是對(duì)2種或以上一線抗癲癇藥物具有耐藥性，這種現(xiàn)象可能是由非特異性機(jī)制介導(dǎo)的。苯妥英鈉、丙戊酸鈉、卡馬西平等傳統(tǒng)抗癲癇藥物是多藥耐藥基因1(MDR1)及其編碼產(chǎn)物P-糖蛋白(P-gp)的作用底物，而MDR1及其編碼產(chǎn)物P-gp在腦組織中表達(dá)豐富，尤其是血腦屏障，可將進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)的抗癲癇藥物泵出，從而使進(jìn)入癲癇病灶部位的抗癲癇藥物濃度降低，繼而導(dǎo)致患兒對(duì)抗癲癇藥物的多藥耐藥。左乙拉西坦是一種新型抗癲癇藥物，其作用機(jī)制與傳統(tǒng)抗癲癇藥物有所不同，主要通過(guò)與其作用靶點(diǎn)——中樞神經(jīng)細(xì)胞突觸囊泡蛋白2A結(jié)合來(lái)發(fā)揮抗癲癇作用[2]。陳嬌等[3]研究發(fā)現(xiàn)，左乙拉西坦可下調(diào)難治性癲癇患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)表達(dá)，進(jìn)而控制癲癇發(fā)作。而P-gp和MRP均為ATP依賴性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制相似。因此，我們推測(cè)左乙拉西坦亦能下調(diào)外周血單個(gè)核細(xì)胞P-gp表達(dá)，但目前相關(guān)報(bào)道較少。本研究觀察了左乙拉西坦對(duì)難治性癲癇患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞MDR1 mRNA和P-gp表達(dá)的影響，旨在探討左乙拉西坦治療難治性癲癇可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年7月～2017年7月無(wú)錫市兒童醫(yī)院收治的難治性癲癇患兒50例。所有患者符合國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟制定的難治性癲癇診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，即接受2種可耐受的、選擇合理且應(yīng)用過(guò)去的抗癲癇治療方案后仍無(wú)效，無(wú)論是單藥還是聯(lián)合治療,均視為難治性癲癇。排除中樞神經(jīng)系統(tǒng)占位性疾病、其他嚴(yán)重的器質(zhì)性疾病、精神疾病以及其他內(nèi)科疾病所致的癇樣發(fā)作(如低血糖、甲狀旁腺功能減退癥、嚴(yán)重心律失常等)。其中，男27例、女23例，年齡2.8～11.0(4.8±1.7)歲；癲癇發(fā)作類型[5]：局灶性起源的癲癇發(fā)作24例，局灶性進(jìn)展為雙側(cè)強(qiáng)直-陣攣發(fā)作6例，全面性起源的癲癇發(fā)作16例，未知起源或不能歸類的癲癇發(fā)作4例。原抗癲癇方案包括丙戊酸鈉+拉莫三嗪、丙戊酸鈉+托吡酯、丙戊酸鈉+氯硝西泮、丙戊酸鈉+奧卡西平、奧卡西平+托吡酯。本研究經(jīng)無(wú)錫市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2 治療方法 所有患兒入組后繼續(xù)原抗癲癇方案治療，同時(shí)給予左乙拉西坦治療，起始劑量10 mg/(kg·d)，每1～2周增加10 mg/kg，逐漸增加至可以控制癲癇發(fā)作的有效劑量，最大劑量60 mg/(kg·d)，連續(xù)治療12個(gè)月。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞MDR1 mRNA和P-gp表達(dá)檢測(cè) ①外周血單個(gè)核細(xì)胞提取：分別于左乙拉西坦治療前及治療6、12個(gè)月，無(wú)菌條件下采集外周靜脈血2 mL，置于EDTA抗凝管中，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞：將2 mL無(wú)菌PBS緩沖液加入EDTA抗凝管中，吹打混勻；在離心管中加入2 mL Ficoll分離液，用滴管沿45°傾斜的管壁緩慢加入稀釋后的外周血并疊加于Ficoll分離液上層，形成清晰界面；18 ℃、2 000 r/min離心20 min，離心管內(nèi)液體分為3層，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧狀狹窄帶，即為單個(gè)核細(xì)胞；將毛細(xì)吸管插入白色云霧狀狹窄帶，緩慢吸取單個(gè)核細(xì)胞，置于另一離心管中，加入5倍以上PBS緩沖液充分洗滌，1 800 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)洗滌、離心2次；末次離心后，棄上清，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，然后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＂谕庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞MDR1 mRNA表達(dá)檢測(cè)：采用RT-PCR法。TRIzol法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，說(shuō)明提取的總RNA純度和濃度合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按兩步法RT-PCR試劑盒說(shuō)明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列[6]：MDR1上游引物5′-AGCCCATCCTGTTTGACTGC-3′，下游引物5′-TGATGCGTGCACATGCTCCTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物165 bp；β-actin上游引物5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′，下游引物5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物263 bp。PCR反應(yīng)體系共25 μL：DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，2×PCR Master mix 12.5 μL，雙蒸餾水8.5 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸45 s共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳(100 V，45 min)分離，采用凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下拍照，Image J軟件進(jìn)行圖像分析處理。以β-actin為內(nèi)參，以目的片段電泳條帶灰度值與內(nèi)參片段電泳條帶灰度值的比值作為MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。③外周血單個(gè)核細(xì)胞P-gp表達(dá)檢測(cè)：采用Western blotting法。按膜蛋白提取試劑盒說(shuō)明提取外周血單個(gè)核細(xì)胞膜蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量合格。然后加入4×loading buffer，煮沸變性。取變性蛋白10 μL行SDS-PAGE，電泳結(jié)束，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入兔抗人P-gp一抗(稀釋比1∶100)、兔抗人β-actin一抗(稀釋比1∶500)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日洗膜后，加入鼠抗兔IgG-HRP二抗(稀釋比1∶1 000)，避光孵育2 h，奧德賽紅外激光成像系統(tǒng)掃描，Image J軟件分析蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為P-gp相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

難治性癲癇患兒左乙拉西坦治療前及治療6、12個(gè)月外周血單個(gè)核細(xì)胞MDR1 mRNA和P-gp表達(dá)比較見表1。

表1 難治性癲癇患兒左乙拉西坦治療前后外周血單個(gè)核細(xì)胞MDR1 mRNA和P-gp相對(duì)表達(dá)量比較

注：與治療前比較，*P<0.05。

3 討論

癲癇是大腦神經(jīng)元突發(fā)異常放電，導(dǎo)致短暫性大腦功能障礙的一種慢性疾病，是兒童時(shí)期常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。國(guó)內(nèi)外對(duì)于癲癇的治療主要以藥物控制為主，大部分患兒的癲癇發(fā)作經(jīng)正規(guī)抗癲癇藥物治療可得到控制，但仍有20%～30%患兒的癲癇發(fā)作狀態(tài)難以控制，這部分癲癇被稱為難治性癲癇。難治性癲癇的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，關(guān)于其發(fā)病機(jī)制的假說(shuō)有藥代動(dòng)力學(xué)假說(shuō)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)假說(shuō)、基因變異假說(shuō)、靶標(biāo)假說(shuō)和轉(zhuǎn)運(yùn)假說(shuō)，但轉(zhuǎn)運(yùn)假說(shuō)是目前關(guān)注的焦點(diǎn)[7，8]。轉(zhuǎn)運(yùn)假說(shuō)是1995年由Tishler等學(xué)者首次提出，目前研究較為清楚的多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體包括ABC超家族B、C、G亞家族成員，特別是P-gp、MRP和乳腺癌耐藥蛋白(如BCRP、ABCG2)。P-gp和MRP同屬ATP結(jié)合的盒式膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，二者均在耐藥性癲癇患者腦組織中高表達(dá)，可將多種抗癲癇藥物泵出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，繼而導(dǎo)致多藥耐藥。而多種傳統(tǒng)抗癲癇藥物不僅是P-gp的作用底物，還能誘導(dǎo)P-gp表達(dá)，從而使癲癇藥物不能充分發(fā)揮作用，這可能是引起難治性癲癇多藥耐藥的重要機(jī)制之一。

左乙拉西坦是一種新型抗癲癇藥物，屬于吡咯烷酮衍生物，其作用機(jī)制比較特殊，既不作用于神經(jīng)遞質(zhì)或受體，對(duì)神經(jīng)元門控鈉離子通道、鈣離子通道也無(wú)影響。目前認(rèn)為，左乙拉西坦既不是P-gp的作用底物，也不誘導(dǎo)P-gp表達(dá)，主要通過(guò)與中樞神經(jīng)元內(nèi)廣泛分布的突觸囊泡蛋白2A結(jié)合，并調(diào)節(jié)突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和突觸囊泡的胞外分泌，進(jìn)而影響神經(jīng)遞質(zhì)釋放[2]。由于其獨(dú)特的作用機(jī)制，當(dāng)與其他抗癲癇藥物合用時(shí)，既不影響其他藥物的血藥濃度，又不易出現(xiàn)藥代動(dòng)力學(xué)的相互作用，安全性和耐受性均較好[9，10]。

MDR是首個(gè)發(fā)現(xiàn)與難治性癲癇相關(guān)的多藥耐藥基因。人類MDR主要由MDR1和MDR2組成，其中發(fā)揮主導(dǎo)作用的是MDR1，共有28個(gè)外顯子，可轉(zhuǎn)錄4.5 kb的mRNA，編碼相對(duì)分子質(zhì)量為170 kD的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，即P-gp。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，P-gp主要分布于腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔膜，其作為能量依賴泵，可通過(guò)水解ATP提供能量，與多種藥物的吸收、分布和代謝有關(guān)，既可阻止外源性有害物質(zhì)的入侵，又可排除內(nèi)源性毒物，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。在生理?xiàng)l件下，P-gp僅在神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞中微量表達(dá)，但在難治性癲癇患者腦組織和外周血中過(guò)表達(dá)[11，12]。P-gp可通過(guò)水解ATP提供的能量將抗癲癇藥物泵入血液，使致癲癇灶內(nèi)藥物濃度降低，進(jìn)而影響抗癲癇藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞癇性放電的抑制作用。而當(dāng)P-gp表達(dá)受到抑制時(shí)，腦組織中抗癲癇藥物濃度可明顯增加[13，14]。因此，P-gp表達(dá)升高和活性增強(qiáng)可使抗癲癇藥物進(jìn)入癲癇灶受到抑制，是導(dǎo)致癲癇多藥耐藥的重要原因之一。有研究發(fā)現(xiàn)，左乙拉西坦可下調(diào)難治性癲癇患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞MRP1、MRP2表達(dá)[3]，而P-gp和MRP在分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制方面具有相似性。因此，我們推測(cè)左乙拉西坦也能下調(diào)難治性癲癇患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞P-gp表達(dá)，但目前國(guó)內(nèi)外鮮有相關(guān)報(bào)道。另外，有研究觀察了左乙拉西坦添加治療難治性癲癇的臨床療效發(fā)現(xiàn)，添加左乙拉西坦治療6、12個(gè)月的臨床療效較好[15]，故本研究選取這兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行觀察。

本研究在原抗癲癇治療基礎(chǔ)上，以左乙拉西坦作為添加治療，觀察了左乙拉西坦治療前后難治性癲癇患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞MDR1 mRNA與P-gp表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，難治性癲癇患兒在添加左乙拉西坦治療6、12個(gè)月外周血單個(gè)核細(xì)胞MDR1 mRNA與P-gp相對(duì)表達(dá)量均較添加左乙拉西坦治療前明顯降低，與于臻等[16]在癲癇幼鼠海馬組織中的研究結(jié)果一致；添加左乙拉西坦治療6、12個(gè)月外周血單個(gè)核細(xì)胞MDR1 mRNA與P-gp相對(duì)表達(dá)量比較雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，二者相對(duì)表達(dá)量有下降趨勢(shì)，這可能與治療時(shí)間短、樣本量少等有關(guān)。結(jié)果表明，左乙拉西坦一方面能使其他抗癲癇藥物更易通過(guò)血腦屏障進(jìn)入癲癇灶，另一方面能使細(xì)胞內(nèi)的抗癲癇藥物泵出減少，從而提高腦組織中抗癲癇藥物濃度，進(jìn)而控制癲癇發(fā)作。

綜上所述，難治性癲癇患兒添加左乙拉西坦治療可下調(diào)外周血單個(gè)核細(xì)胞MDR1 mRNA與P-gp表達(dá)，這為難治性癲癇治療提供了新的思路。但難治性癲癇的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，轉(zhuǎn)運(yùn)假說(shuō)僅是其多藥耐藥的機(jī)制之一，左乙拉西坦是否還能通過(guò)其他機(jī)制治療難治性癲癇尚需進(jìn)一步探索。