原發性肝癌組織TACC3、p53蛋白表達變化及其與患者臨床病理特征和預后的關系

馬洪斌，劉建勇，盧誠震

(1 天津市寧河區醫院，天津301500；2 天津市第二人民醫院)

原發性肝癌是臨床常見的消化系統惡性腫瘤之一，近年來其發病率有明顯上升趨勢[1，2]。原發性肝癌起病比較隱匿，早期一般無明顯癥狀，當出現明顯肝區疼痛、黃疸、腹水等癥狀時，病情已屬中晚期，患者預后較差。盡管近年來以外科手術為主的綜合治療取得了很大進展，但原發性肝癌術后復發率和轉移率仍然較高[3]。因此，進一步探索原發性肝癌發病的分子機制，有可能為其診斷和治療提供新的思路。轉錄相關酸性卷曲蛋白3(TACC3)基因定位于染色體4p16.3，含有高度保守的C-末端卷曲螺旋結構域，其主要功能是在細胞有絲分裂時保持中心體微管成核穩定和中心體完整性[4]。有研究發現，原發性肝癌細胞TACC3表達升高，而敲除TACC3則可抑制腫瘤細胞增殖[5]。p53蛋白是一種相對分子質量為43.7 kD的蛋白質，主要分布于細胞核，可參與細胞周期調控、細胞凋亡、DNA損傷修復等生物學過程。有研究發現，TACC3基因通過與p53基因相互作用，繼而調節p53基因功能。在正常細胞中，TACC3基因表達變化可能會影響細胞紡錘體功能，這時依賴p53基因的檢查點會發現細胞未進行有絲分裂，從而誘導細胞凋亡。如果p53基因發生突變，則不能誘導細胞凋亡，繼而導致腫瘤形成[6]。本研究觀察了原發性肝癌組織TACC3、p53蛋白表達變化，并分析其表達變化與患者臨床病理特征和預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年6月～2015年6月天津市寧河區醫院收治的初診原發性肝癌患者112例。所有患者經組織病理檢查明確診斷[7]，且入院前未行任何抗腫瘤治療。排除合并重要臟器嚴重疾病者、不能配合治療或隨訪者。其中，男78例、女34例，年齡39～72(55．2±14.8)歲；腫瘤數目：單發92例，多發20例；腫瘤最大直徑：<5 cm 81例，≥5 cm 31例；臨床分期[8]：Ⅰ期30例，Ⅱ期47例，Ⅲ期例21例，Ⅳ期14例；組織分化程度：高中分化78例，低未分化34例；有淋巴結轉移69例，無淋巴結轉移43例。本研究經天津市寧河區醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 TACC3、p53蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取肝癌組織與癌旁組織(距腫瘤組織邊緣>2 cm)各112例份，RIPA裂解液充分裂解，提取組織總蛋白，經BCA法蛋白定量合格。加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴10 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白50 μg，行SDS-PAGE(5%濃縮膠，15%分離膠)，濃縮膠電壓90 V，分離膠電壓120 V。當溴酚藍跑膠至電泳槽下端時停止電泳，電泳時間約3 h。電泳結束，采用濕轉法將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜上(恒流200 mA轉膜2 h)。50 g/L脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，分別加入兔抗人TACC3一抗(稀釋比1∶500)、兔抗人p53單克隆抗體(稀釋比1∶500)、β-actin一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(稀釋比1∶5 000)，室溫孵育2 h。ECL發光，暗室中曝光、顯影。采用凝膠成像分析系統掃描，Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 隨訪 所有患者出院后定期采用電話或門診方式隨訪，隨訪截至2018年6月。以患者死亡或至隨訪截至日期結束隨訪，統計3年生存率。

2 結果

2.1 肝癌組織與癌旁組織TACC3、p53蛋白表達比較 肝癌組織與癌旁組織TACC3相對表達量分別為0.79±0.21、0.37±0.13，p53蛋白相對表達量分別為0.80±0.11、0.41±0.14。肝癌組織TACC3、p53蛋白相對表達量均明顯高于癌旁組織(t分別為2.431、3.422，P均<0.05)。

2．2 肝癌組織TACC3表達與p53蛋白表達的關系 Pearson相關分析顯示，肝癌組織TACC3表達與p53蛋白表達呈正相關關系(r=0.613，P<0.05)。

2.3 肝癌組織TACC3、p53蛋白表達與患者臨床病理特征的關系 肝癌組織TACC3、p53蛋白表達與腫瘤最大直徑、臨床分期、組織分化程度、淋巴結轉移有關(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤數目無關(P均>0.05)。見表1。

2.4 不同TACC3、p53蛋白表達者預后比較 所有患者隨訪2～36個月，中位隨訪時間27個月。隨訪期間死亡75例，無失訪。以TACC3、p53蛋白表達的平均值為臨界值，將患者分為TACC3或p53蛋白高表達者與低表達者。其中，TACC3高表達者與低表達者分別為58、54例，其3年生存率分別為27.5%(16/58)、38.8%(21/54)；p53蛋白高表達者與低表達者分別為60、52例，其3年生存率分別為23.3%(14/60)、44.2%(23/52)。TACC3、p53蛋白高表達者3年生存率均明顯低于其低表達者(χ2分別為4.843、4.020，P均<0.05)。見圖1、2。

表1 肝癌組織TACC3、p53蛋白表達與患者臨床病理特征的關系

圖1 不同TACC3表達者生存曲線

圖2 不同p53表達者生存曲線

3 討論

原發性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其病因和發病機制尚不完全清楚。目前，臨床上常用的腫瘤標志物，如甲胎蛋白、熱休克蛋白、癌胚抗原等，對原發性肝癌的早期診斷、病情評估和預后判斷等價值有限[9]。因此，進一步探索原發性肝癌發病的分子機制，尋找一種敏感性和特異性均較高的腫瘤標志物具有重要意義。

有絲分裂是真核生物細胞分裂的主要方式，具有周期性。細胞周期發生異常，易引起染色體不穩定、基因突變等。中心體由一對中心粒組成，是微管的組織中心，可參與有絲分裂和分裂間期過程中微管的調節。轉錄相關酸性卷曲蛋白(TACC)是有絲分裂紡錘體的重要組成部分，其C端存在高度保守的TACC結構域，使其聚集在中心體卷曲螺旋中。TACC3是TACC家族成員之一。近年研究發現，在結直腸癌、前列腺癌等組織中TACC3高表達，且其高表達與腫瘤進展和患者不良預后有關[10，11]。在有絲分裂期間，TACC3定位于中心體，并可與chTOG蛋白、網格蛋白一起形成一種復合物，穩定中心體微管并保持中心體完整性。TACC3過表達可通過影響細胞周期調節因子，促進腫瘤細胞繞過細胞周期通路的檢查點；而通過shRNA干擾TACC3表達，可使腫瘤細胞處于G1期阻滯狀態[12]。本研究結果發現，原發性肝癌組織TACC3相對表達量明顯高于癌旁組織，與賀偉等[13]報道一致。本研究還發現，原發性肝癌組織TACC3表達與腫瘤最大直徑、臨床分期、組織分化程度、淋巴結轉移有關，而與患者性別、年齡和腫瘤數目無關。說明TACC3可能參與原發性肝癌的發生、發展。進一步研究發現，TACC3高表達者3年生存率明顯低于TACC3低表達者。Ha等[14]研究表明，原發性肝癌細胞TACC3高表達時，上皮間質轉化(EMT)相關蛋白表達增加，如S100A4、ezrin、uPAR等，繼而激活磷脂酰肌醇3-激酶和細胞外信號調節蛋白激酶信號通路，從而促進腫瘤細胞發生EMT。因此，TACC3高表達者預后不良可能與TACC3促進EMT，繼而導致腫瘤進展有關。

p53基因是細胞內一個重要的細胞周期檢查點。當各種因素導致基因組DNA損傷后，p53基因可上調p21基因表達，抑制細胞周期蛋白依賴性激酶2，使細胞周期阻滯于G1期。p53基因突變后，使p53蛋白空間構象改變，繼而影響p53蛋白磷酸化及生物學功能，導致突變型p53蛋白在細胞內大量堆積。突變型與野生型p53蛋白結合，進一步抑制p53基因功能，導致細胞異常增殖。p53基因對中心體活性和細胞周期調控具有重要意義。有研究表明，p53基因可誘導中心體缺陷使細胞周期G1期阻滯[15]，細胞分裂失敗，繼而逃避檢查點檢查，最終引起多效性缺陷。由于不均等分離，中心體擴增和非整倍性導致腫瘤進一步惡化。有研究發現，約75%胰腺癌患者存在p53基因突變，從而導致中心體擴增和染色體結構不穩定，繼而促進腫瘤侵襲和轉移[16]。本研究結果發現，原發性肝癌組織p53蛋白相對表達量明顯高于癌旁組織；原發性肝癌組織p53蛋白表達與腫瘤最大直徑、臨床分期、組織分化程度、淋巴結轉移有關，而與患者性別、年齡、腫瘤數目無關；p53蛋白高表達者3年生存率明顯低于p53蛋白低表達者。上述結果與郭曉東等[17]報道一致。說明p53蛋白亦可參與原發性肝癌的發生、發展。本研究還發現，TACC3與p53蛋白表達呈正相關關系。表明TACC3可能通過影響p53蛋白表達，參與細胞周期調控。TACC3是EMT的啟動子，能被內皮細胞、成纖維細胞、免疫細胞等膜上的受體激活，從而促進腫瘤進展；Wnt信號通路異常，可引起TACC3過表達，胞質內游離的β-catenin進入胞核，激活下游癌基因，如p53、Ras等[18，19]。因此，抑制腫瘤細胞TACC3表達，p53信號通路亦受到抑制，從而逆轉腫瘤細胞G1期阻滯。

綜上所述，原發性肝癌組織TACC3、p53蛋白表達明顯升高，其表達變化與腫瘤進展和患者預后不良有關。TACC3、p53蛋白有可能成為診斷原發性肝癌的生物學標志物和治療靶點。