ID3過表達對肝細胞癌多柔比星化療敏感性的影響及其機制

王海容，杜海燕

(1 鹽城市第二人民醫院，江蘇鹽城224002；2 鹽城市第一人民醫院)

原發性肝癌是臨床常見的消化系統惡性腫瘤，其中85%～90%為肝細胞癌(HCC)[1]。手術切除是目前腫瘤治療最有效的手段，但HCC早期癥狀隱匿、缺少特異性，多數患者就診時已處于晚期，錯過了最佳手術時機，化療成為其重要治療手段。多柔比星(DOX)是臨床常用的廣譜、高效抗腫瘤藥物，是HCC的一線化療藥物。但大多數HCC患者在應用DOX過程中易產生耐藥性[2]，從而導致化療失敗，最終引起腫瘤進展[3～5]。因此，逆轉HCC細胞對DOX的化療耐藥性，對改善患者預后具有重要意義。分化抑制因子3(ID3)是螺旋-環-螺旋(HLH)轉錄因子家族成員之一，是腫瘤發生、發展過程中的關鍵調節因子[6]。最近研究發現，ID3具有化療增敏潛能，可逆轉順鉑耐藥A549細胞的多藥耐藥性[7]。但ID3與HCC DOX化療敏感性的關系鮮有報道。2017年6月～2018年10月，我們觀察了ID3過表達對HCC DOX化療敏感性的影響，并探討其可能的作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞系HepG2(以下稱HepG2細胞)，美國ATCC細胞庫；人肝癌阿霉素(ADM)耐藥細胞系HepG2(以下稱HepG2/ADM細胞)，廣州吉妮歐生物科技有限公司。DOX、嘌呤霉素，美國Sigma公司。ID3過表達慢病毒質粒(oe-ID3)、陰性對照慢病毒質粒(oe-NC)，由上海吉凱基因化學技術有限公司設計合成。所有引物由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成。Mastercycler Ep Realplex實時熒光定量PCR儀，德國Eppendorf公司；Multiskan MK3型酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；熒光倒置顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社；Mini-PROTEAN Tetra電泳儀，美國Bio-Rad公司。PrimeScriptTMRT Reagent Kit逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒，日本TaKaRa株式會社；MTS試劑、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒，南京凱基生物科技發展有限公司。鼠抗人ID3一抗、鼠抗人pPI3K一抗，美國Abcam公司；鼠抗人pAKT一抗、鼠抗人GAPDH一抗、HRP標記的羊抗鼠二抗，美國Proteintech公司。

1.2 HepG2/ADM細胞與HepG2細胞ID3 mRNA表達檢測 將HepG2/ADM細胞接種于含10% FBS的RPMI 1640培養基，HepG2細胞接種于含10% FBS的DMEM高糖培養基，均置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養。當細胞融合90%左右時，收集細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒說明將總RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，按SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒說明進行PCR擴增。引物序列：ID3上游引物5′-GAGAGGCACTCAGCTTAGCC-3′，下游引物5′-TCCTTTTGTCGTTGGAGATGAC-3′；GAPDH上游引物5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。PCR反應條件：95 ℃預變性5 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s共40個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 細胞分組轉染 取對數生長期HepG2/ADM細胞，接種于含DMEM高糖培養基的6孔板，每孔1×105個，隨機分為對照組和實驗組，每組設3個復孔。然后將6孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養。培養24 h，實驗組加入oe-ID3和Lipofectamine2000轉染試劑，對照組加入oe-NC和Lipofectamine2000轉染試劑，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中轉染8 h，更換新的DMEM高糖培養基，繼續轉染16 h。收集兩組轉染24 h細胞，按1.2中的方法，檢測ID3 mRNA相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4 兩組DOX IC50值檢測 收集兩組轉染24 h細胞，接種于含DMEM高糖培養基的96孔板，每孔4×103個。然后將96孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養。當細胞融合30%左右時，每組分別加入0、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800、1 600、3 200 μg/mL DOX，每個濃度設6個復孔。DOX反應72 h，加入MTS試劑30 μL，37 ℃孵育2 h。酶標儀于490 nm波長處檢測各孔的吸光度(OD)值，計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗孔OD490值-空白孔OD490值/對照孔OD490值-空白孔OD490值)×100%。當細胞存活率為50%時所對應的DOX濃度，即為DOX的IC50值。實驗重復3次，取平均值。

1.5 兩組細胞凋亡率檢測 ①TUNEL凋亡染色法：取傳2代、對數生長期、生長狀態良好的HepG2/ADM細胞，接種于6孔板(孔內含0.1 μg/mL DOX的DMEM高糖培養基)，每孔1×106個，按1.3中的方法分組轉染。轉染24 h，收集細胞，4%多聚甲醛固定30～60 min，加入TUNEL染色液100 μL，37 ℃避光孵育1 h，然后滴加含DAPI的抗熒光淬滅封片劑50 μL，熒光倒置顯微鏡下觀察。實驗重復3次，取平均值。②流式細胞術：取傳2代、對數生長期、生長狀態良好的HepG2/ADM細胞，接種于6孔板(孔內含0.1 μg/mL DOX的DMEM高糖培養基)，每孔1×106個，按1.3中的方法分組轉染。轉染24 h，收集細胞，用不含EDTA的胰酶消化，Binding Buffer 500 μL重懸，然后分別加入Annexin V-FITC 5 μL、PI 5 μL，充分混勻，37 ℃避光孵育30 min，上流式細胞儀檢測。實驗重復3次，取平均值。

1.6 兩組PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達檢測 取傳2代、對數生長期、生長狀態良好的HepG2/ADM細胞，接種于6孔板(孔內含0.1 μg/mL DOX的DMEM高糖培養基)，每孔1×106個，按1.3中的方法分組轉染。轉染24 h，收集細胞，胰酶消化，RIPA裂解液冰上充分裂解，4 ℃、14 000 r/min離心30 min，提取細胞總蛋白，經BCA法蛋白定量合格。然后加入5倍的上樣緩沖液，煮沸變性。取變性蛋白50 μg，SDS-PAGE分離蛋白。電泳結束，采用濕轉法將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜上。然后用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入pPI3K(1∶500)、pAKT(1∶500)和Bcl-2(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日，加入HRP標記的羊抗鼠二抗(1∶8 000)，室溫孵育2 h。ECL發光，暗室中曝光、顯影。以GAPDH為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 HepG2/ADM細胞與HepG2細胞ID3 mRNA表達比較 HepG2/ADM細胞ID3 mRNA相對表達量為0.24±0.04，HepG2細胞為1.00±0.11，兩者比較P<0.05。

2.2 兩組ID3 mRNA表達比較 實驗組ID3 mRNA相對表達量為13.54±2.33，對照組為1.00±0.00，兩組比較P<0.05。

2.3 兩組DOX的IC50值比較 0、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800、1 600、3 200 μg/mL DOX作用72 h，對照組細胞存活率分別為(100.00±1.12)%、(97.34±5.61)%、(89.54±3.74)%、(80.95±6.83)%、(73.44±3.41)%、(69.59±5.49)%、(62.13±2.34)%、(42.32±7.69)%、(31.68±3.57)%、(20.93±2.32)%、(15.15±3.21)%，實驗組分別為(100.00±1.54)%、(92.15±4.38)%、(84.69±6.80)%、(73.07±7.01)%、(65.12±5.98)%、(57.33±2.47)%、(40.32±4.18)%、(27.32±4.05)%、(17.21±3.11)%、(15.21±1.24)%、(15.01±1.01)%。經計算，對照組DOX的IC50值為(0.25±0.04)μg/mL，實驗組DOX的IC50值為(0.12±0.03)μg/mL，兩組比較P<0.05。

2.4 兩組細胞凋亡率比較 ①TUNEL凋亡染色法：實驗組細胞凋亡率為(22.34±0.24)%，對照組為(7.41±0.31)%，兩組比較P<0.05；②流式細胞術：實驗組細胞凋亡率為(19.57±0.29)%，對照組為(1.03±0.11)%，兩組比較P<0.05。

2.5 兩組PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達比較 見表1。

表1 兩組PI3K/AKT信號通路相關蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

HCC是臨床常見的消化系統惡性腫瘤之一，全世界每年約有50萬新發病例，我國占一半以上[8，9]。由于HCC早期癥狀隱匿且較早出現轉移，大多數患者無法行根治性手術[10]，化療成為其重要治療手段。DOX是HCC的一線化療藥物，可通過結合腫瘤細胞DNA，降低DNA聚合酶活性，抑制腫瘤細胞增殖；還可嵌入DNA堿基對，阻礙腫瘤細胞DNA復制、轉錄，誘導腫瘤細胞G2期阻滯。此外，DOX還能通過生成自由基、結合細胞膜等作用發揮抗腫瘤活性[11]。化療耐藥是HCC治療失敗的主要原因[2]，同樣DOX應用過程中也易產生耐藥性，是造成患者預后不良的原因之一[12]。因此，逆轉HCC細胞對DOX的化療耐藥，對改善患者預后具有重要意義。但HCC化療耐藥的機制非常復雜，至今仍未明確。

ID3基因編碼含有HLH結構的蛋白質，能控制細胞周期中的多種基因，為負性轉錄調控因子[6]。已有研究證實，ID3與實體腫瘤的發生、發展密切相關。Antonangelo等[13]報道，在肺腺癌組織中ID3高表達，且其高表達與淋巴結轉移和患者不良預后有關。在小鼠脾T細胞淋巴瘤的發生、發展過程中，ID3具有腫瘤抑制作用，ID2/ID3雙敲除后淋巴瘤迅速進展[12]。最近研究發現，ID3可逆轉順鉑耐藥A549細胞的多藥耐藥性[13]，且在黑色素瘤中ID3能夠調控介導細胞遷移和耐藥相關基因SOX10、MITF表達[14]。表明ID3可能與腫瘤化療敏感性有關。但ID3與HCC DOX化療敏感性的關系鮮有報道。

本研究首先觀察了HepG2/ADM細胞與HepG2細胞ID3 mRNA表達，結果發現，HepG2/ADM細胞ID3 mRNA相對表達量明顯低于HepG2細胞，提示ID3與HCC化療耐藥有關。采用瞬時轉染技術使HepG2/ADM細胞ID3過表達，觀察其DOX的IC50值，結果發現，實驗組DOX的IC50值明顯高于對照組，說明ID3過表達可增加HepG2/ADM細胞對DOX的化療敏感性。腫瘤化療耐藥的機制非常復雜，涉及藥物代謝和凋亡途徑改變等。有研究表明，ID3可誘導暴露于紫外線的永生化人角質細胞凋亡[15]；ID3以Elk-1/Caspase-8依賴途徑介導皮膚癌A431細胞凋亡，并能與5-氟尿嘧啶、順鉑發揮協同作用[16]。本研究采用TUNEL凋亡染色法和流式細胞術檢測兩組在DOX的IC50時細胞凋亡率，結果發現，實驗組細胞凋亡率明顯高于對照組，表明ID3過表達能明顯提高DOX處理的HepG2/ADM細胞凋亡。因此推測，ID3可能是通過調節細胞凋亡方式，促進HCC對DOX的化療敏感性。PI3K/AKT信號通路在腫瘤的發生、發展過程中具有重要作用[17]。近年研究發現，PI3K/AKT信號通路還能調控多種腫瘤細胞化療耐藥所必需的蛋白表達[18，19]。PI3K/AKT信號通路可以磷酸化多種底物和下游效應分子，如Forkhead家族成員、Caspase家族、細胞周期蛋白家族和Bcl-2凋亡蛋白家族[20]。本研究觀察了兩組PI3K/AKT信號通路中pPI3K、pAKT蛋白及凋亡蛋白Bcl-2表達變化，結果發現，實驗組pPI3K、pAKT、Bcl-2蛋白相對表達量均明顯低于對照組。表明ID3過表達能夠通過抑制PI3K/AKT信號通路中相關蛋白表達，提高HCC對DOX的化療敏感性。

綜上所述，ID3過表達可提高HCC對DOX的化療敏感性，其機制與抑制PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達有關。