肝門部膽管腺癌組織TGR5表達變化與上皮間質轉化和患者預后的關系

鄭躍，程龍，許承，汪濤

(1 川北醫學院，四川南充637000；2 西部戰區總醫院)

膽管癌是起源于膽管樹黏膜上皮的惡性腫瘤，約占消化系統惡性腫瘤的3%，其中約50%為肝門部膽管癌。手術切除是惟一可能治愈膽管癌的方法。但肝門部膽管癌解剖位置特殊，根治性切除率較低，并且術后易出現侵襲和轉移，故患者術后5年生存率僅20%～30%[1]。G蛋白偶聯膽汁酸受體5(TGR5)是G蛋白偶聯受體超家族成員，可參與膽汁代謝、能量代謝等。已有研究證實，TGR5可促進腫瘤形成，但其與腫瘤侵襲和轉移的關系尚無定論[2]。上皮間質轉化(EMT)是上皮細胞轉化為具有間質細胞表型的生物學過程，其表型特征包括E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、細胞角蛋白19(CK19)等上皮細胞標志物表達下調，N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)等間質細胞標志物表達上調[3]。EMT在腫瘤的侵襲和轉移過程中具有重要作用。有研究發現，在胃癌MKN45細胞中TGR5高表達，其高表達與腫瘤進展密切相關[4]。但目前鮮見TGR5表達與膽管癌侵襲和轉移關系的報道。本研究觀察了肝門部膽管腺癌組織TGR5表達變化，并分析其表達與腫瘤進展和患者預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月～2018年1月西部戰區總醫院普通外科中心收治的肝門部膽管腺癌患者59例。所有患者經術后組織病理檢查明確診斷。納入標準：①符合肝門部膽管腺癌診斷；②初診，術前未行任何抗腫瘤治療；③均行根治性手術；④臨床病理資料完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤者；②合并肝、腎等重要臟器功能障礙者；③圍手術期因手術并發癥死亡者。其中，男27例、女32例，年齡32～76(59.14±10.41)歲；組織分化程度：低分化16例，中低分化15例，中分化17例，高中分化8例，高分化3例；有淋巴結轉移18例，無淋巴結轉移41例；有神經受累21例，無神經受累38例。本研究經西部戰區總醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 檢測方法 采用免疫組化法。取手術切除的膽管癌組織及其癌旁組織(距腫瘤組織邊緣≥5 cm)，中性甲醛固定，常規脫水、透明，石蠟包埋，4 μm厚連續切片。將切片置于60 ℃烤箱烤片30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，檸檬酸鹽抗原修復液修復抗原。山羊血清封閉15 min，分別加入兔抗人TGR5、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、CK19、鋅指結構轉錄因子1(ZEB1)一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入生物素化二抗，37 ℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

采用雙盲法由兩位病理科醫師獨立閱片。TGR5陽性染色定位于細胞膜、細胞質，呈淺黃色至棕褐色顆粒狀；E-cadherin、N-cadherin陽性染色定位于細胞膜，呈淺黃色至棕褐色顆粒狀；Vimentin、CK19陽性染色定位于細胞質，呈淺黃色至棕褐色顆粒狀；ZEB1蛋白陽性染色定位于細胞核，呈淺黃色至棕褐色顆粒狀。每張切片隨機選取3個400倍視野，顯微鏡下拍照，數字切片掃描設備掃描，采用Image J軟件分析各視野灰度值。以其灰度值表示目的蛋白相對表達量。灰度值越低，表明目的蛋白相對表達量越高。實驗重復3次，取平均值。

1.3 隨訪 所有患者術后采用電話或門診方式定期隨訪，隨訪截至2018年6月，共隨訪5～60個月，統計患者總生存時間和無瘤生存時間。總生存時間為腫瘤確診日期至隨訪截至日期或死亡的時間。無瘤生存時間為手術日期至隨訪截至日期或復發的時間。以膽管癌組織TGR5相對表達量的平均值為臨界值，將患者分為TGR5高表達者和低表達者。比較不同TGR5表達者總生存時間和無瘤生存時間。

2 結果

2.1 膽管癌組織與癌旁組織TGR5、EMT相關標志物及ZEB1蛋白表達比較 見表1。

2.2 膽管癌組織TGR5表達與EMT相關標志物及ZEB1蛋白表達的關系 Pearson相關分析顯示，膽管癌組織TGR5表達與E-cadherin、CK19表達均呈負相關關系(r分別為-0.718、-0.774，P均<0.05)，與Vimentin、N-cadherin、ZEB1蛋白表達均呈正相關關系(r分別為0.763、0.817、0.698，P均<0.05)。

表1 膽管癌組織與癌旁組織TGR5、EMT相關標志物及ZEB1蛋白相對表達量比較

注：與癌旁組織比較，*P<0.05。

2.3 膽管癌組織TGR5表達與患者臨床病理特征的關系 59例膽管癌患者中，TGR5高表達者30例，TGR5低表達者29例。膽管癌組織TGR5表達與腫瘤組織分化程度、淋巴結轉移、神經受累有關(P均<0.05)，與患者性別、年齡無關(P均>0.05)。見表2。

表2 膽管癌組織TGR5表達與患者臨床病理特征的關系

2.4 不同TGR5表達者術后無瘤生存時間和總生存時間比較 TGR5高表達者與TGR5低表達者術后無瘤生存時間分別為(22.21±2.15)、(38.69±1.65)個月，總生存時間分別為(25.04±2.28)、(42.35±1.66)個月。TGR5高表達者術后無瘤生存時間、總生存時間均明顯低于TGR5低表達者(P均<0.05)。見圖1、2。

圖1 不同TGR5表達者無瘤生存時間曲線

圖2 不同TGR5表達者總生存時間曲線

3 討論

肝門部膽管腺癌早期無明顯臨床癥狀，多數患者就診時已屬中晚期，錯過了根治性手術的最佳時機[5]。由于肝門部膽管腺癌早期即可出現侵襲和轉移，患者術后5年生存率較低[6]。

TGR5主要表達于胃、腸、肝等器官，基因定位于染色體2q35，開放閱讀框包含993個堿基，共編碼330個氨基酸。TGR5可被膽汁酸激活并內化進入細胞質中，通過誘導cAMP產生激活下游信號通路。既往認為，TGR5主要參與膽汁代謝、能量代謝等調控過程。近年研究發現，TGR5作為膽汁酸的天然體內配體，可參與多種腫瘤的發生、發展，但其具體作用機制尚不清楚[7]。有研究發現，在非小細胞肺癌組織中TGR5異常表達，且其表達與腫瘤臨床分期有關。敲除TGR5基因可阻止JAK2、STAT3的磷酸化，并抑制STAT3靶基因表達，繼而抑制非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲和遷移。當腫瘤細胞從原發部位向遠隔器官遷移時，腫瘤細胞會逐漸喪失自身細胞極性并減少與周圍細胞的連接，立方上皮細胞向紡錘纖維細胞形態轉變，導致組織松散，腫瘤細胞遷移和運動能力增強[8]。這種上皮細胞表型向間質細胞表型轉化的生物學過程被稱為EMT。目前認為，EMT是導致腫瘤侵襲和轉移的重要機制之一[9，10]，E-cadherin、CK19、N-cadherin、Vimentin是其重要蛋白標志物[11～14]。有研究證實，TGR5表達與胃癌、肺癌等惡性腫瘤EMT密切相關[15]。但TGR5表達與膽管癌EMT和患者預后的關系鮮有報道。

本研究結果顯示，膽管癌組織TGR5表達明顯高于癌旁組織，且其上皮細胞標志物E-cadherin、CK19表達明顯低于癌旁組織，間質細胞標志物N-cadherin、Vimentin表達明顯高于癌旁組織。本研究結果發現，膽管癌組織TGR5表達與E-cadherin、CK19表達均呈負相關關系，與Vimentin、N-cadherin表達均呈正相關關系。結果表明，TGR5表達上調可能促進膽管癌細胞向間質細胞轉化，繼而促進腫瘤侵襲和轉移。miR-200-ZEB1是EMT公認的核心調控步驟之一[8，16]。ZEB1可調控上皮細胞相關基因表達進而參與EMT過程[17]。有研究發現，在肝內膽管腫瘤細胞核內ZEB1蛋白表達高于正常膽管上皮細胞，并且其高表達與腫瘤侵襲和患者預后有關[18，19]。因此，膽管癌組織ZEB1蛋白表達變化可反映EMT過程。為進一步驗證結果的準確性，本研究還觀察了膽管癌組織與癌旁組織ZEB1蛋白表達變化，并分析膽管癌組織ZEB1蛋白表達與TGR5表達的關系。結果顯示，膽管癌組織ZEB1蛋白表達明顯高于癌旁組織，并且膽管癌組織ZEB1蛋白表達與TGR5表達呈正相關關系，驗證了上述結論的可靠性。

本研究結果發現，膽管癌組織TGR5表達與腫瘤組織分化程度、淋巴結轉移、神經受累有關，與患者性別、年齡無關。說明TGR5表達與膽管癌的侵襲和轉移有關。本研究還發現，TGR5高表達者術后無瘤生存時間、總生存時間均明顯低于TGR5低表達者。結果表明，TGR5高表達與膽管癌患者預后不良有關，有可能作為預測患者預后的生物學標志物。

綜上所述，肝門部膽管腺癌組織TGR5高表達，其高表達與腫瘤的侵襲和轉移以及患者不良預后有關。TGR5有可能成為預測肝門部膽管腺癌進展和患者預后的生物標志物。但本研究僅是一項單中心回顧性研究，且樣本量相對較小，其結論準確性尚需進一步驗證。