胃癌組織lncRNA MEG3、GAS5表達變化及其與患者臨床病理特征和預后的關系

徐瀚斌，章由賢，劉放，高曉慧，朱以祥

(湖北省中西醫結合醫院，武漢430015)

胃癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，由于其早期癥狀不典型，大部分患者確診時已處于進展期，常伴有淋巴結或腹腔臟器轉移，預后較差，5年總生存率不足10%[1]。但目前對胃癌發病的分子機制尚不完全清楚。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉錄本長度超過200 nt的RNA分子，它們并不編碼蛋白，但可與DNA、RNA或蛋白質相互作用，通過基因印記、染色質重塑、細胞周期調控等機制，參與基因表達調控。近年研究發現，多種腫瘤組織中lncRNA異常表達，并與腫瘤的發生、發展密切相關[2，3]。母系表達基因3(MEG3)是第一個被發現具有抑癌基因功能的lncRNA，可通過抑制腫瘤血管生成，阻止腫瘤惡性進展。有研究報道，在肺癌、宮頸癌等組織中MEG3表達缺失，其表達缺失可促進腫瘤血管生成，繼而導致腫瘤惡性進展[4]。生長特異抑制物5(GAS5)亦為近年發現的、具有腫瘤抑制功能的lncRNA。已有研究報道，在乳腺癌、前列腺癌等組織中GAS5低表達，其低表達可促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移[5]。但目前鮮見胃癌組織MEG3、GAS5表達的報道。為此，本研究觀察了胃癌組織MEG3、GAS5表達變化，并分析其表達變化與患者臨床病理特征和預后關系?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年7月～2014年12月湖北省中西醫結合醫院收治的胃癌患者73例。所有患者經術后病理或活檢病理檢查明確診斷。納入標準：①符合胃癌診斷，且病理學類型為腺癌；②初診，入院前未行任何抗腫瘤治療；③臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標準：①非胃腺癌或病理學類型難以判斷者；②合并其他部位惡性腫瘤或重要器官功能不全者；③臨床病理資料或隨訪資料不完整者。其中，男42例、女31例，年齡32～75(55.42±16.31)歲；腫瘤直徑：<5 cm 37例，≥5 cm 36例；組織分化程度：低未分化39例，中高分化34例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期38例，Ⅲ、Ⅳ期35例；有淋巴結轉移43例，無淋巴結轉移30例。本研究經湖北省中西醫結合醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 MEG3、GAS5表達檢測 采用real-time PCR法。取胃癌組織及其配對的癌旁正常組織(距腫瘤組織邊緣≥5 cm)，采用TRIzol法提取組織總RNA，經紫外分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，表明提取的總RNA純度合格，可用于后續實驗。采用AMV逆轉錄酶將總RNA逆轉錄為cDNA，-80 ℃保存。以cDNA為模板，按熒光定量PCR試劑盒說明進行PCR擴增。所有引物由武漢華聯科生物技術有限公司設計合成。引物序列：MEG3上游引物5′-CTGCCCATCTACACCTCACG-3′，下游引物5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3′；GAS5上游引物5′-CTTCTGGGCTCAAGTGATCCT-3′，下游引物5′-TTGTGCCATGAGACTCCATCAG-3′；GAPDH上游引物5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游引物5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。PCR反應體系共20 μL：1 μmol/L的上下游引物混合物0.5 μL，cDNA 1 μL，Taq酶0.5 μL，SYBR-Green 1 μL，Buffer 2 μL，dNTPs 1 μL，去離子水14 μL；反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火60 s、60 ℃延伸60 s共40個循環。每個樣品設3個復孔。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 隨訪 所有患者術后采用門診、電話等形式定期隨訪，隨訪截至2018年5月，隨訪時間9～66個月、中位隨訪時間32個月，統計患者生存時間和術后3年生存率。以胃癌組織MEG3、GAS5相對表達量的均值為臨界值，高于臨界值作為高表達，低于或等于臨界值作為低表達。比較MEG3、GAS5高表達者與低表達者生存時間和術后3年生存率。

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織MEG3、GAS5表達比較 胃癌組織與癌旁正常組織MEG3相對表達量分別為0.71±0.26、1.16±0.32，GAS5相對表達量分別為0.62±0.34、1.11±0.42。胃癌組織MEG3、GAS5相對表達量均明顯低于癌旁正常組織(t分別為-9.325、-7.748，P均<0.05)。

2.2 胃癌組織MEG3、GAS5表達與患者臨床病理特征的關系 胃癌組織MEG3、GAS5表達與腫瘤組織分化程度、臨床分期和淋巴結轉移有關(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑無關(P均>0.05)。見表1。

2.3 胃癌組織MEG3、GAS5表達與患者預后的關系 MEG3高表達者與低表達者分別為36、37例，其術后生存時間分別為(39.94±12.13)、(32.11±10.24)個月，術后3年生存率分別為83.33%(30/36)、62.16%(23/37)，二者術后生存時間和術后3年生存率比較差異均有統計學意義(t/χ2分別為2.983、4.112，P均<0.05)。GAS5高表達者與低表達者分別為38、35例，其術后生存時間分別為(39.45±15.56)、(32.28±10.19)個月，術后3年生存率分別為84.21%(32/38)、60.00%(21/35)，二者術后生存時間和術后3年生存率比較差異均有統計學意義(t/χ2分別為2.308、5.369，P均<0.05)。見圖1、2。

表1 胃癌組織MEG3、GAS5表達與患者臨床病理特征的關系

圖1 不同MEG3表達者生存曲線

圖2 不同GAS5表達者生存曲線分析

3 討論

我國是胃癌的高發國家，每年新發病例達40萬例，占全世界的50%以上，已成為威脅我國居民生命健康的重要疾病之一。由于胃癌早期癥狀缺乏特異性，多數患者確診時已處于進展期，預后較差。但目前對胃癌發病的分子機制尚不清楚。

lncRNA是一類轉錄本長度超過200 nt的RNA分子，它們并不編碼蛋白，以往被認為是基因轉錄過程中的“噪音”，不具有生物學功能。隨著基因組學研究的深入發現，lncRNA可在表觀遺傳、轉錄及轉錄后水平調控基因表達，并參與腫瘤的發生、發展[6]。MEG3是小鼠母系印記基因GTL2的人類同系物，定位于人染色體14q32.3，長度約1.6 kb，僅表達于母源性基因，是第一個被發現具有抑癌基因功能的lncRNA。MEG3在正常組織中廣泛表達，尤其在腦、卵巢等組織中表達較高[7]。近年研究發現，MEG3在胰腺癌中可發揮抑癌基因作用，敲除MEG3可使胰腺癌細胞增殖、侵襲和遷移能力明顯增強，并發現MEG3低表達的胰腺癌患者預后較差[8]。Zheng等[9]研究表明，MEG3過表達可抑制肝癌細胞增殖。此外，MEG3低表達還可增加60歲以下人群罹患結直腸癌的風險[10]。目前認為，MEG3可能是通過調節miR-21或p53信號通路，抑制腫瘤血管生成，從而阻止腫瘤惡性進展[11，12]。GAS5為近年發現的、具有腫瘤抑制功能的lncRNA，屬GAS家族成員，位于人類1號染色體長臂2區5帶，全長4 087 bp，由12個外顯子組成。在人體肝、腎和血管等組織中均能檢測到GAS5表達。在卵巢癌、肝細胞癌等組織中GAS5低表達，其低表達可促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移[13，14]。Liu等[15]研究發現，在結直腸癌組織或患者血液中GAS5表達均明顯降低，并且GAS5低表達的結直腸癌細胞增殖和遷移能力明顯增強。有研究證實，在胃癌組織或細胞中GAS5表達受到抑制，并且GAS5低表達還能降低腫瘤細胞對阿霉素的敏感性，進一步研究發現，其作用機制可能與抑制ERK信號通路激活有關[16]。Guo等[17]研究認為，GAS5對胃癌細胞的抑制作用可能是通過調控p21、CDK6蛋白表達，將腫瘤細胞阻滯于G1/S期，從而抑制腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡。雖然已有研究證實，MEG3、GAS5低表達與肝癌、乳腺癌和胰腺癌等腫瘤進展和患者預后不良有關，但二者表達變化與胃癌進展和患者預后的關系目前報道較少。

本研究結果顯示，胃癌組織MEG3、GAS5表達均明顯低于癌旁正常組織，提示MEG3、GAS5可能在胃癌的發生、發展中具有抑癌基因作用。本研究結果還發現，胃癌組織MEG3、GAS5表達與腫瘤組織分化程度、臨床分期和淋巴結轉移有關，與患者性別、年齡、腫瘤直徑無關，提示MEG3、GAS5低表達與胃癌進展有關。本研究結果還發現，MEG3、GAS5低表達者中位生存時間較MEG3、GAS5高表達者均明顯縮短，其術后3年生存率亦明顯低于MEG3、GAS5高表達者，表明MEG3、GAS5低表達的胃癌患者術后生存時間更短，預后更差。

綜上所述，胃癌組織MEG3、GAS5低表達，其低表達與胃癌進展和患者預后不良有關。但由于本研究樣本量較小，其結論準確性尚需大樣本量、多中心研究進一步驗證。