敲低lncRNA SNHG16對胃癌細胞凋亡的影響及其機制

周春歡，劉娟娟，夏萬松，夏英，萬穎，黃海

(1 貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，貴陽550004；2 湖南醫(yī)藥學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院；3 貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；4廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院)

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多基因參與的復(fù)雜過程[1]，其病因和發(fā)病機制尚不完全明確。根治性手術(shù)是目前惟一有可能治愈胃癌的手段。但由于胃癌早期癥狀不典型，多數(shù)患者就診時已屬中晚期，錯過了最佳手術(shù)時機，即使可以手術(shù)治療，術(shù)后也極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，尋找新的腫瘤治療方法迫在眉睫。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子，它們并不編碼蛋白，而是以RNA的形式在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。起初lncRNA被認為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不具有生物學(xué)功能。目前已證實，lncRNA可參與X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾等調(diào)控過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA還可參與腫瘤細胞的增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)過程[2，3]。核內(nèi)小RNA宿主基因16(SNHG16)定位于人類染色體17q25.1，是最早在神經(jīng)母細胞瘤中發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA[4]。有研究報道，在結(jié)直腸癌、膀胱癌、乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG16高表達，并可參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[5～7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織lncRNA SNHG16高表達，且其高表達與腫瘤進展和患者預(yù)后不良有關(guān)[8]。但lncRNA SNHG16能否調(diào)控胃癌細胞凋亡及其具體的作用機制尚不清楚。2017年11月～2018年7月，我們觀察了敲低lncRNA SNHG16對胃癌細胞凋亡的影響，并探討其可能的作用機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌高分化細胞株AGS(以下稱AGS細胞)，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，由貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院中心實驗室于液氮罐中保存。si-SNHG16序列：正義鏈5′-CCCAGUGUUGACUCACCAATT-3′，反義鏈5′-UUGGUGAGUCAACACUGGGTT-3′；陰性對照序列(si-NC)：正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。si-SNHG16、si-NC序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成。SNHG16、HPRT引物由本課題組前期設(shè)計[8]，p53引物由Primer6.0軟件設(shè)計。SNHG16、HPRT、p53引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。實時熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司；流式細胞儀，美國Backman Coulter公司。LipofectamineTMRNAiMax轉(zhuǎn)染試劑、Opti-MEM培養(yǎng)基，美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)，日本TaKaRa公司；UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司。p53、Bax兔源性單克隆抗體，美國Abcam公司；Cleaved Caspase-3兔源性多克隆抗體，美國CST公司；Bcl-2兔源性多克隆抗體，沈陽萬類生物科技有限公司；GAPDH，南京巴傲得生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；Immobilon Western HRP底物化學(xué)發(fā)光液,美國Millipore公司；Gene Gnome凝膠成像分析系統(tǒng)，廣州儀濤科學(xué)儀器有限公司；RIPA裂解液、Hoechst 33342染色液，北京索萊寶科技有限公司；Caspase-3活性檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒，沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2 細胞分組處理 ①細胞培養(yǎng)：從液氮罐中取出凍存的AGS細胞，立即置于37 ℃水浴迅速融化，然后將細胞接種于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合85%左右時，按1∶3傳代。②細胞轉(zhuǎn)染：取傳3代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的AGS細胞，用不含雙抗的完全培養(yǎng)基輕輕吹打重懸，然后將細胞懸液接種于6孔板，每孔2 mL。隨機將細胞分為空白對照組、陰性對照組、si-SNHG16組，每組設(shè)3個復(fù)孔。將6孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中，當細胞融合50%～70%時，si-SNHG16組加入含si-SNHG16序列4 μL和LipofectamineTMRNAiMax轉(zhuǎn)染試劑4 μL的Opti-MEM培養(yǎng)基，陰性對照組加入含si-NC序列4 μL和LipofectamineTMRNAiMax轉(zhuǎn)染試劑4 μL的Opti-MEM培養(yǎng)基，空白對照組僅加入等量Opti-MEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h更換為新的無血清培養(yǎng)基。

1.3 各組lncRNA SNHG16、p53基因表達檢測 采用qRT-PCR法。收集各組轉(zhuǎn)染48 h細胞，使用UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒提取細胞總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA完整。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)說明進行PCR擴增。引物序列：SNHG16上游引物5′-GTGTAAGGATCTTCATGATG-3′，下游引物5′-GCTGGGAGCTAACTCACATT-3′，擴增片段長度163 bp；p53上游引物5′-CCACCATCCACTACAACTAC-3′，下游引物5′-CAAACACGCACCTCAAAG-3′，擴增片段長度136 bp；HPRT上游引物5′-CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT-3′，下游引物5′-AGACGTTCAGTCCTGTCCATAA-3′，擴增片段長度131 bp。PCR反應(yīng)體系共20 μL：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)10 μL，上下游引物各1 μL，滅菌雙蒸水7 μL，cDNA模板1 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40個循環(huán)。以HPRT為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 各組細胞凋亡檢測 ①采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術(shù)。取傳3代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的AGS細胞，按上述方法分組、轉(zhuǎn)染。收集各組轉(zhuǎn)染48 h細胞，用PBS潤洗2次，吸棄PBS，用不含EDTA的胰酶消化1～2 min；加入適量完全培養(yǎng)基終止消化，移液槍輕輕吹打，用預(yù)冷的PBS調(diào)整細胞懸液密度為1×106個/mL，1 000 r/min離心5 min，盡可能吸除殘余液體；加入Binding buffer 500 μL重懸，避光條件下依次加入Annexin V-FITC、PI各5 μL，充分混勻，室溫反應(yīng)30 min，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復(fù)3次，取平均值。②采用Hoechst 33342染色法。取傳3代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的AGS細胞，用巴氏吸管輕輕吹打成單細胞懸液，并接種于24孔板，每孔500 μL。次日，按上述方法分組、轉(zhuǎn)染。各組轉(zhuǎn)染48 h，吸除孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS潤洗2次，每孔加入Hoechst 33342染液200 μL，然后將24孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱。孵育30 min左右，去除染液，PBS沖洗2次，吸棄PBS。將24孔板置于熒光顯微鏡下觀察。每組隨機選取5個200倍視野，計數(shù)每視野凋亡細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 各組p53、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取傳3代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的AGS細胞，按上述方法分組、轉(zhuǎn)染。收集各組轉(zhuǎn)染48 h細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，3 500 r/min離心5 min，棄上清，加入適量的RIPA裂解液冰上裂解30 min，提取細胞總蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量合格。然后加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸變性。取變性蛋白40 μg行SDS-PAGE(濃縮膠均為5%，p53、GAPDH分離膠為10%，Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3分離膠為15%)，恒壓80 V跑膠約30 min，待蛋白進入分離膠時調(diào)整電壓至120 V，當?shù)鞍准磳⑴艹龇蛛x膠時停止電泳。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入p53(1∶2 000)、Bax(1∶5 000)、Bcl-2(1∶500)、Cleaved Caspase-3(1∶1 000)、GAPDH(1∶20 000)一抗，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜10 min×3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(1∶20 000)，室溫孵育1 h。TBST洗膜10 min×3次，Immobilon Western HRP底物化學(xué)發(fā)光液發(fā)光、顯影。采用Gene Gnome凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.6 各組Caspase-3酶活性檢測 取傳3代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的AGS細胞，按上述方法分組、轉(zhuǎn)染。收集各組轉(zhuǎn)染48 h細胞，4 ℃下1 000 r/min離心5 min，棄上清。PBS洗滌1次，按上述條件再次離心，棄上清，加入適量RIPA裂解液冰上裂解15 min，提取細胞總蛋白，經(jīng)Bradford法鑒定蛋白濃度合格。按照Caspase-3活性檢測試劑盒說明配制反應(yīng)體系，37 ℃孵育4 h，酶標儀于400 nm波長處檢測各組吸光度(OD)值。以O(shè)D400值作為Caspase-3酶活性。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組lncRNA SNHG16、p53基因表達比較 si-SNHG16組、陰性對照組、空白對照組lncRNA SNHG16相對表達量分別為0.26±0.01、1.00±0.07、0.97±0.06，p53基因相對表達量分別為2.09±0.17、1.00±0.02、0.87±0.03。si-SNHG16組lncRNA SNHG16相對表達量明顯低于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)，p53基因相對表達量明顯高于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)，而陰性對照組與空白對照組lncRNA SNHG16、p53基因相對表達量比較P均>0.05。

2.2 各組細胞凋亡情況比較 Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，si-SNHG16組細胞凋亡率為(7.19±1.16)%，陰性對照組為(2.99±1.02)%，空白對照組為(3.20±1.30)%。si-SNHG16組細胞凋亡率明顯高于陰性對照組、空白對照組(P均<0.05)，而陰性對照組與空白對照組比較P>0.05。

Hoechst 33342染色法結(jié)果顯示，si-SNHG16組、陰性對照組、空白對照組細胞凋亡數(shù)分別為(18.8±3.1)、(6.8±2.3)、(4.6±1.1)個。si-SNHG16組細胞凋亡數(shù)明顯高于陰性對照組、空白對照組(P均<0.05)，而陰性對照組與空白對照組比較P>0.05。

2.3 各組p53、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達比較 見表1。

表1 各組p53、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白相對表達量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05。

2.4 各組Caspase-3酶活性比較 si-SNHG16組、陰性對照組、空白對照組Caspase-3酶活性分別為1.40±0.06、1.00±0.02、0.93±0.02。si-SNHG16組Caspase-3酶活性明顯高于陰性對照組、空白對照組(P均<0.05)，而陰性對照組與空白對照組比較P>0.05。

3 討論

據(jù)全球癌癥報告顯示，2018年預(yù)計全球新發(fā)胃癌約103.37萬例，死亡約78.27萬例，其發(fā)病率、病死率分別居所有惡性腫瘤的第5位和第3位[9]。我國是胃癌高發(fā)國家，每年新發(fā)病例41萬左右，約占全球新發(fā)病例的40%[10]。由于胃癌起病隱匿，多無典型臨床表現(xiàn)，大多數(shù)患者就診時已處于中晚期，錯過了根治性手術(shù)的最佳時機，因此臨床治療效果不甚滿意。

lncRNA是一類不編碼蛋白質(zhì)，但具有廣泛基因表達調(diào)控作用的非編碼RNA分子，其可通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平參與多種生命活動的調(diào)控過程[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤組織中l(wèi)ncRNA異常表達，在促進和維持腫瘤進展中發(fā)揮重要作用，已成為腫瘤領(lǐng)域的研究熱點[11～13]。一般認為，lncRNA的作用具有4種模式，即信號傳導(dǎo)、分子阻斷、引導(dǎo)作用、中心平臺，通過這4種模式的相互作用，參與基因的表觀遺傳調(diào)控和轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[14,15]。SNHG16是近年在神經(jīng)母細胞瘤中發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，定位于人染色體17q25.1。Feng等[16]研究發(fā)現(xiàn)，SNHG16可通過調(diào)控miR-98/STAT3/Wnt/β-catenin信號軸，參與膀胱癌的侵襲和轉(zhuǎn)移；Han等[17]研究發(fā)現(xiàn)，SNHG16在非小細胞肺癌組織中高表達，其表達變化與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后密切相關(guān)。有研究還發(fā)現(xiàn)，SNHG16作為miRNA海綿吸附分子，可通過“ceRNA”機制與目標基因競爭性結(jié)合miRNA分子并調(diào)控靶基因，從而參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[18～20]。腫瘤的發(fā)生與細胞凋亡調(diào)控失常密切相關(guān)。當細胞凋亡機制遭到破壞，會導(dǎo)致腫瘤不可控地生長[21～24]。但目前鮮見lncRNA SNHG16調(diào)控胃癌細胞凋亡的報道。本研究采用RNA干擾技術(shù)敲低lncRNA SNHG16，發(fā)現(xiàn)AGS細胞凋亡率和凋亡數(shù)均明顯增加，提示lncRNA SNHG16可能參與胃癌細胞的凋亡調(diào)控。

p53作為“基因組的守衛(wèi)者”，當DNA受損時，可使細胞生命周期停滯或啟動細胞凋亡程序，從而抑制腫瘤形成[25～28]。Bcl-2家族在細胞凋亡信號通路中具有重要作用。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族最具代表性的凋亡調(diào)控因子。Bcl-2可通過阻止凋亡形成因子釋放，如線粒體細胞色素C，從而抑制細胞凋亡；而Bax可通過與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，促使凋亡形成因子釋放，從而促進細胞凋亡[29，30]。有研究發(fā)現(xiàn)，p53可通過線粒體途徑來誘導(dǎo)細胞凋亡，其機制可能與促進Bax表達、抑制Bcl-2表達有關(guān)[31，32]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，si-SNHG16組p53表達明顯高于空白對照組和陰性對照組，提示lncRNA SNHG16可能參與p53的調(diào)控。進一步研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組和陰性對照組比較，si-SNHG16組促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)、抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)。提示lncRNA SNHG16可能參與AGS細胞中Bax、Bcl-2凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控。Caspase-3是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，可導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)的全面解體。在細胞凋亡早期階段，Caspase-3被激活，轉(zhuǎn)變成Cleaved Caspase-3，進而裂解相應(yīng)的胞質(zhì)或胞核底物，最終導(dǎo)致細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，敲低lncRNA SNHG16，Caspase-3酶活性增加，Cleaved Caspase-3蛋白表達上調(diào)。提示lncRNA SNHG16還可通過調(diào)控細胞凋亡信號通路中Caspase-3酶活性，從而引起胃癌細胞凋亡。因此，我們認為lncRNA SNHG16可能直接或間接參與p53信號通路下游凋亡相關(guān)蛋白調(diào)控，從而介導(dǎo)胃癌細胞凋亡。

綜上所述，敲低lncRNA SNHG16可促進胃癌細胞凋亡，其機制可能與激活p53信號通路下游凋亡相關(guān)蛋白表達，繼而啟動細胞凋亡程序有關(guān)。