MMP-2 和MMP-9 在聲帶息肉中表達的比較及其相關性研究

寧金梅，吳 平，鈕 燕，趙樹波，孫 勇

（1．曲靖市第一人民醫院 耳鼻咽喉科，云南 曲靖 655000；2．昆明醫科大學第二附屬醫院 耳鼻喉科，云南 昆明 650101）

已進行了大量關于基質金屬蛋白酶（MMPs）在生理和病理情況下生物學行為的研究，MMPs通過降解細胞外基質、基底膜和其它蛋白，促進細胞轉移，在腫瘤的發生發展過程中起著重要作用[1-12]。其中最重要的是明膠酶，包括明膠酶A（MMP-2）和明膠酶B（MMP-9），其相對分子質量MMP-9為92 000（92KD），MMP-2為72 000（72KD），又稱IV 型膠原酶，可有效降解基底膜的主要成分IV型膠原及明膠，還降解V，VII，X型膠原，彈性蛋白和層粘蛋白等，因此導致組織水腫、血管內細胞通過血管內皮基底膜遷移到血管外而引起一序列病理變化。有研究表明：MMP-2和MMP-9參與組織結構重塑，在炎癥和腫瘤中表達量都顯著增高[13,14]。研究發現MMP9的基質降解作用比MMP2 高出近25倍，MMP9 在粘膜內胃癌轉移中的作用比MMP2更強[15-18]。我們前期研究已證實，聲帶息肉組MMP-2和MMP-9 陽性單位均值均＞正常聲帶組，有統計學差異（P＜0.05）。現進一步對MMP-2和MMP-9在聲帶息肉中表達進行比較，并進行相關性研究，以進一步探討聲帶息肉的發病機制，為臨床治療聲帶息肉提供新的思路和理論依據。

資料與方法

一、臨床資料 實驗組：選擇近年聲帶息肉患者標本35例，其中男性22例，女性13例，年齡24～62 歲，平均年齡為41歲，病程1月～8年，均經病理診斷確診，且排除其他聲帶病變。所有患者均為初次手術。對照組：正常聲帶組織標本18例（因非喉部疾病死亡24～48h內的尸體標本，或病理科保存的正常聲帶組織標本蠟塊）。

二、試驗方法 2組標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，作4μm 厚的連續切片，HE染色，選取標本中細胞成分多的部位作切片進行免疫組織化學染色。

三、結果判斷 陽性判斷標準：與邁新公司的陽性對照片中陽性細胞相比。相同或比其深者為陽性，比其弱或沒有染色者為陰性。MMP-2和MMP-9 均以細胞漿出現黃色為陽性細胞，將每張切片著色強度與著色細胞數量進行分級。陽性細胞計數：0～5%為-，6%～15%為±，16%～25%為+，26%～50%為++，＞50%為+++。陽性細胞表達強度：-無著色或染色與邁新公司的陽性對照片中陽性細胞相比比其弱，+黃色，++棕黃色，+++棕色。

四、圖像定量分析 應用Nikon Eclipse 50i計算機圖像分析儀，在400 倍鏡下對行MMP-2 和MMP-9 染色的切片每張隨機選取3個視野的上皮細胞和相鄰的細胞間質。因聲帶息肉病理組織學變化多樣，為增加研究的可比性，在MMP-2 和MMP-9 的連續切片中，選取的視野相同。用Nikon Mivnt 顯微圖像分析軟件（WindowsXP版），每個視野隨機圈定3個陽性單位（3個陽性細胞的細胞質），測定這3個陽性單位均值代表該視野的陽性單位均值。用陽性單位均值表示被染色物質的多少，陽性單位均值越大，說明物質的相對含量越高，即抗原物質表達的水平越高，反之亦然。

結 果

一、免疫組化觀察結果

1．MMP-2 在正常聲帶和聲帶息肉中的表達MMP-2 定位于細胞漿，細胞核無著色。陰性對照片中未見陽性反應。MMP-2在正常聲帶和聲帶息肉中均呈程度不一的陽性反應，MMP-2在正常聲帶組中，陽性反應主要位于炎性細胞、成纖維細胞。在炎性細胞的表達：計數和表達強度均大多為++；在成纖維細胞的表達：計數為－～+，表達強度為－～++。血管內皮細胞、上皮細胞、橫紋肌及軟骨細胞也有表達，但表達較弱，見圖1。MMP-2 在聲帶息肉組中，陽性反應主要位于上皮細胞、成纖維細胞、炎性細胞、和血管內皮細胞。在上皮細胞的表達：計數和表達強度均為+～++；在成纖維細胞的表達：計數為±～++，表達強度為+～++；在炎性細胞的表達：計數為：±～+，表達強度大多為++；在血管內皮細胞的表達：計數為：－～+，表達強度：－～++，大多為++。在間質也有表達，見圖2～4。

2．MMP-9 在正常聲帶和聲帶息肉中的表達

MMP-9在正常聲帶組中，陽性反應主要位于炎性細胞、成纖維細胞和上皮細胞。不同的標本中各種細胞的表達可不一樣，常以某一種細胞的表達為主，表達計數大多為+，強度多為+～++。也表達于血管內皮細胞、橫紋肌和軟骨細胞，見圖5。在聲帶息肉組中，幾乎所有切片上皮細胞、成纖維細胞、炎性細胞、和血管內皮細胞都明顯表達MMP-9。在上皮細胞的表達：計數和表達強度均在+～++之間；在成纖維細胞的表達：計數大多為+～+++，表達強度大多為++；在炎性細胞的表達：計數多為+～+++，表達強度大多為++；在血管內皮細胞的表達：計數多為+～+++，表達強度大多為++，見圖6～9。

結 果

一、正常聲帶和聲帶息肉MMP-2陽性單位均值比較

正常聲帶和聲帶息肉組間MMP-2陽性單位均值比較有統計學差異，見表1，聲帶息肉組陽性單位均值（30.5666±7.18438）＞正常聲帶組（16.1361±4.32634）。

二、正常聲帶和聲帶息肉MMP-9陽性單位均值比較

正常聲帶和聲帶息肉組間MMP-9陽性單位均值比較有統計學差異，見表2，聲帶息肉組陽性單位均值（42.9661±9.80116）＞正常聲帶組（16.6147±8.48336）。

三、聲帶息肉組織中MMP-9與MMP-2陽性單位均值比較

聲帶息肉組中MMP-9與MMP-2陽性單位均值比較有統計學差異，見表3，MMP-9陽性單位均值（42.9661±9.80116）＞MMP-2（30.5666±7.18438）。

四、聲帶息肉組織中MMP-9與MMP-2表達的相關性分析

在進行相關性分析之前先用聲帶息肉中MMP-9 和MMP-2陽性單位均值做散點圖，兩變量之間不存在線性趨勢，見圖10，說明沒有相關性，未做pearson相關分析。

討 論

聲帶是聲音的振動器官，聲音產生的質量取決于聲帶獨特的層次結構。對聲帶本身而言，其張力大小、長短、厚薄，皆對聲音高低有影響[19]。聲帶固有層是與聲帶的發音功能直接相關的重要組織結構，特別是固有層淺層的形態和緊張度決定了聲帶振動的特性。發聲過程中，聲帶振動最明顯的是任克氏間隙，大多數聲帶病變起源于固有層，如果這一層出現炎癥、新生物和瘢痕，聲帶就會變得僵硬，振動就會受到影響，音質就會發生改變[20]。細胞外基質的清除和合成之間的平衡是維持聲帶正常形態和功能的重要機制，聲帶息肉和Reinke's間隙水腫可能是基質的降解與合成失衡所致。細胞外基質的調節涉及許多蛋白質成分，如膠原和彈性蛋白，這些蛋白質的降解或再生由基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs），如明膠酶和彈性蛋白酶等的控制，而MMPs則受金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs） 調控。正常的細胞外基質有賴于基質蛋白、MMPs和TIMPs間的平衡。基底膜（basement membrane,BM） 是細胞和結締組織交界處的細胞外基質，代表細胞外骨架、具有結構支持，細胞附著和選擇濾過的功能。

在正常生理情況下，MMPs能調節細胞粘著、作用于細胞外成分或其它蛋白成分而啟動潛在生物學功能、直接或間接參與胚胎發育、組織模型再塑及創傷修復等正常生理功能[21]。病理情況下，MMPs 在炎癥反應、血管生成及腫瘤侵襲、轉移中發揮重要作用[22-24]。Vaiva Lesauskaite等[25]用免疫組織化學方法研究MMP-2和MMP-9在聲帶息肉組織中的表達，結果顯示：MMP-9在上皮細胞的表達無論是聲帶息肉組還是正常聲帶組都顯著強于MMP-2 的表達，這支持我們的研究結果。本實驗中，用聲帶息肉中MMP-9和MMP-2陽性單位均值做散點圖，兩變量之間不存在線性趨勢，說明沒有相關性。我們推測MMP-9和MMP-2在聲帶息肉的表達可能存在著獨立的調節機制，MMP-9和MMP-2 的上調或下調不會影響另一方的表達。

表1 正常聲帶和聲帶息肉MMP-2 陽性單位均值比較

表2 正常聲帶和聲帶息肉MMP-9 陽性單位均值比較

表3 聲帶息肉組織中MMP-9與MMP-2陽性單位均值比較

圖1 MMP-2 在正常聲帶上皮和固有層中的表達（免疫組化MaxVisionTM法，×200）；

圖3 MMP-2 在聲帶息肉組織中的表達，著色于上皮細胞和纖維細胞（免疫組化MaxVisionTM 法，×400）；

圖4 MMP-2在聲帶息肉組織中的表達，著色于纖維細胞和炎性細胞（免疫組化MaxVisionTM法，×400）；

圖5 MMP-9 在正常聲帶組織固有層中的表達，主要著色于纖維細胞和炎性細胞（免疫組化MaxVisionTM 法，×200）；

圖6 MMP-9 在聲帶息肉組織中的表達，主要著色于炎性細胞和血管內皮細胞（免疫組化MaxVisionTM×200）；

圖7 MMP-9 在聲帶息肉組織中的表達，主要著色于上皮細胞和纖維細胞（免疫組化MaxVisionTM 法，×200）；

圖8 MMP-9 在聲帶息肉組織中的表達，主要著色于纖維結締組織和血管壁（免疫組化MaxVisionTM 法，×400）；

圖9 MMP-9 在聲帶息肉組織中的表達，主要著色于血管內皮細胞（免疫組化MaxVisionTM 法，×200）；

圖10 聲帶息肉組織中MMP-9 和MMP-2 陽性單位均值散點圖。

MMP-9和MMP-2在聲帶息肉中的表達明顯＞正常聲帶組織，差異有統計學意義，我們推測明膠酶可能在聲帶息肉的病理生理方面發揮著重要作用，參與了組織結構的重塑。MMP-9和MMP-2在聲帶息肉組織中的表達有統計學差異，MMP-9的表達明顯＞MMP-2，表明在聲帶息肉的發生發展中MMP-9似乎起到了更重要的作用。MMP-9和MMP-2 在聲帶息肉中的表達可能存在著獨立的調節機制，其中一方的表達不受另一方的影響。對于聲帶息肉病人，同時抑制MMP-2和MMP-9，可望成為一種更好的治療方案。