CDKN2A單核苷酸基因多態(tài)性與妊娠糖尿病伴HBV感染的臨床相關(guān)研究

余水泉

(重慶市涪陵中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，重慶 408000)

妊娠糖尿病(GDM)是指孕婦在懷孕前沒(méi)有糖尿病，懷孕中或生產(chǎn)后才發(fā)現(xiàn)的糖尿病。近年來(lái)，GDM在孕婦中的比例呈上升趨勢(shì)[1-3]，其危害眾多，尤其是對(duì)病毒性肝炎孕婦，不但影響胎兒在母體內(nèi)的正常發(fā)育、增加母體和新生兒多種并發(fā)癥的發(fā)生，還會(huì)增加母體再次妊娠時(shí)糖尿病復(fù)發(fā)率。因此，探究GDM的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)行早期診斷，對(duì)干預(yù)治療降低GDM對(duì)母嬰的危害具有重要意義。國(guó)內(nèi)外研究表明，病毒性肝炎會(huì)增加孕婦患妊娠糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[4]，另一方面，細(xì)胞周期依賴性激酶抑制基因(CDKN2A)基因多態(tài)性與妊娠期糖尿病也有一定的相關(guān)性[5-6]，病毒性肝炎、CDKN2A基因多態(tài)性與妊娠糖尿病相關(guān)性如何，臨床研究報(bào)道較少。本研究以本院收治的健康孕婦、乙型肝炎孕婦為研究對(duì)象，采用飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)CDKN2A基因的多態(tài)性，分析探討乙型病毒性肝炎、CDKN2A基因多態(tài)性與妊娠糖尿病的相關(guān)性，為臨床提供一定參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年9月至2017年5月本院收治的攜帶慢性乙型肝炎病毒(HBV)的孕婦240例和未感染孕婦260例。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)攜帶慢性HBV：血清中HBsAg和HBV DNA呈陽(yáng)性，肝功能正常的孕婦；(2)GDM：所有妊娠24～32周行75 g口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)檢測(cè)：空腹血糖>5.3 mmol/L,餐后1 h血糖>10.0 mmol/L,餐后2 h血糖>8.5 mmol/L，達(dá)到上述三項(xiàng)之一者,可診斷GDM。若上述節(jié)點(diǎn)血糖水平均小于臨界值，則診斷為正常糖耐量(NGT)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕期合并其他感染，如妊娠高血壓患者，感染單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、風(fēng)疹病毒、HIV等。(2)患有脂肪肝、肝硬化或肝癌等影響正常肝功能的孕婦。(3)孕前應(yīng)用糖皮質(zhì)激素類藥物、細(xì)胞毒性藥物等。(4)胎兒發(fā)育異?；蚨嗵ピ袐D。根據(jù)參與孕婦是否含有HBV，將所有孕婦分為兩組：攜帶慢性HBV的孕婦240例(A組)，未感染HBV孕婦280例(U組)作為對(duì)照組。然后根據(jù)孕婦是否為GDM，將A組患者分為A1(HBV攜帶的GDM孕婦)和A2(HBV攜帶的非GDM孕婦)，U組患者分為U1(無(wú)攜帶的GDM孕婦)和U2(無(wú)攜帶的非GDM孕婦)。所有對(duì)象在知情同意下，簽署知情同意書，兩組患者的一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見(jiàn)表1。

1.2方法 兩組孕婦空腹12 h后，口服75 g葡萄糖1 h，2 h，3 h后檢測(cè)各孕婦的血糖含量和各組孕婦的糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。根據(jù)OGTT的GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)，分析比較兩組患者的GDM發(fā)病率。提取、保存各患者的DNA，采用飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)所有孕婦的基因型(送至重慶醫(yī)科大學(xué)進(jìn)行檢測(cè))，具體步驟如下：首先PCR擴(kuò)增目的基因序列，將患者DNA與芯片基質(zhì)共結(jié)晶后放入質(zhì)譜儀的真空管；然后用強(qiáng)激光激發(fā)使基質(zhì)晶體升華，核酸分子解吸附并轉(zhuǎn)變?yōu)閬喎€(wěn)態(tài)離子，在真空小管中飛行到達(dá)檢測(cè)器，最后檢測(cè)出各基因分型。分析孕婦CDKN2A基因rs10811661的三種基因型TT,TC,CC的分布及等位基因T和C的分布頻率。

表1 兩組孕婦一般資料的比較

2 結(jié) 果

2.1兩組患者妊娠糖尿病發(fā)病率比較 A組患者的GDM發(fā)病率與U組患者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.2兩組患者基因型分布的哈代-溫伯格定律檢驗(yàn)結(jié)果 本研究提供500例患者，TT基因型181例，TC基因型183例，CC基因型136例，根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律公式：

[p(A)+q(a)]2=p2(AA)+2pq(Aa)+q2(aa)

p=(181×2+183)/1 000=0.545

q=(136×2+183)/1 000=0.455

計(jì)算H-W期望數(shù)=N(p2AA 2pqAa q2aa)，最后P>0.05，無(wú)顯著性差異。因此，本研究入選患者的基因型分布符合哈代-溫伯格定律。

2.3兩組患者的基因型分析及等位基因分布頻率比較 A組中，A1組孕婦182例，A2組孕婦58例；U組中，U1組孕婦60例，U2組孕婦200例。CDKN2A基因rs10811661的TT,TC,CC三種基因型的分布在A1與A2中,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),U1與U2組之間差異不明顯(P>0.05)。CDKN2A基因rs10811661的TT,TC,CC三種基因型的分布在A1組與U1組有顯著差異(P<0.05)；A1組危險(xiǎn)基因T的分布頻率高于U1組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 兩組患者妊娠糖尿病發(fā)病率比較[n(%)]

注：和U1組相比，aP<0.05

3 討 論

糖尿病是由各種致病因子作用于機(jī)體導(dǎo)致胰島素供應(yīng)不足或胰島素在靶細(xì)胞不能發(fā)揮正常生理作用下，使體內(nèi)糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝發(fā)生紊亂的臨床綜合征。GDM對(duì)母嬰的主要危害是增加了胎兒在宮內(nèi)發(fā)育異常、新生兒窒息、畸形等不良結(jié)局的發(fā)生[7-8]。因此，GDM的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療具有重要意義。目前，GDM的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，但有研究報(bào)道，病毒性肝炎孕婦GDM發(fā)病率高于健康孕婦群體。肝臟是參與糖代謝的重要器官，感染HBV后，病毒繁殖激發(fā)機(jī)體正常的免疫系統(tǒng)，發(fā)生自身免疫，導(dǎo)致肝臟功能異常，進(jìn)而會(huì)影響正常的糖代謝，甚至導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生[9-10]。此外，還有研究顯示，位于9號(hào)染色體上的CDKN2A，抑制CDK4和CDK6的活性，CDK4的過(guò)表達(dá)又影響胰島B細(xì)胞的功能，使其受損從而減少胰島素的分泌，和Ⅱ型糖尿病的發(fā)生有關(guān)。在病毒性肝炎中，肝細(xì)胞CDKN2A的過(guò)表達(dá)和肝進(jìn)行性纖維化、肝癌及膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系[11-15]。

本研究通過(guò)收集并比較本院收治的乙型病毒性肝炎孕婦及健康孕婦的GDM發(fā)病率發(fā)現(xiàn)，HBV感染孕婦GDM發(fā)病率為75.8%，而健康孕婦的GDM發(fā)病率為23.1%，HBV感染孕婦的GDM發(fā)病率顯著增加(P<0.05)。這一結(jié)果說(shuō)明，HBV侵襲破壞肝臟細(xì)胞，使得孕婦肝功能異常肝臟受損，從而影響肝臟中的糖代謝過(guò)程，惡性循環(huán)最終會(huì)導(dǎo)致機(jī)體糖代謝發(fā)生紊亂。由于孕婦處于特殊時(shí)期，機(jī)體代謝負(fù)擔(dān)加重，一旦出現(xiàn)糖代謝紊亂很可能增加GDM的發(fā)病率。同時(shí)，本研究還將感染HBV攜帶GDM的孕婦與感染HBV的NGT孕婦進(jìn)行了CDKN2A基因rs10811661分布多態(tài)性的比較，發(fā)現(xiàn)兩組患者CDKN2A基因的三種TT、TC、CC基因型分布明顯不同，感染HBV攜帶GDM的孕婦TT顯著增高(P<0.05)。未感染HBV患有GDM的孕婦與未感染HBV的NGT孕婦相比，CDKN2A基因rs10811661的三種基因型的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但是感染HBV的GDM孕婦中與未感染HBV的GDM孕婦中有顯著差異，CDKN2A基因rs10811661的危險(xiǎn)基因T的分布率也明顯不同。上述結(jié)果表明HBV感染、CDKN2A基因rs10811661 T/C多態(tài)性和GDM的發(fā)病具有相關(guān)性。機(jī)制可能是患有乙型病毒性肝炎，同時(shí)攜帶危險(xiǎn)等位基因T的孕婦的胰島B細(xì)胞更易受損。但由于GDM是一種由遺傳、環(huán)境與生活習(xí)慣等因素共同引起的疾病，又因本研究樣本數(shù)量有限，故有待于進(jìn)行大樣本、多基因、多因素的聯(lián)合分析。

本研究首次探究了HBV攜帶GDM孕婦和無(wú)HBV感染GDM孕婦的CDKN2A基因多態(tài)性分布情況。發(fā)現(xiàn)HBV攜帶GDM孕婦CDKN2A基因分布和HBV無(wú)GDM孕婦差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),等位基因T出現(xiàn)的頻率明顯增加。與此同時(shí)，與健康GDM孕婦相比，HBV攜帶GDM孕婦危險(xiǎn)基因T的分布頻率顯著上升(P<0.05)，證實(shí)病毒性肝炎和CDKN2A基因rs10811661T/C多態(tài)性是GDM的發(fā)病有一定的相關(guān)性，是其發(fā)病的重要影響因素。