大腸癌組織中VEGF-D、VEGFR-3表達及淋巴管生成的相關性研究

朱建洲，于 農，劉 芳

(蘇州高新區人民醫院檢驗科，江蘇蘇州 215129)

隨著人們生活水平提高、飲食結構的變化，我國大腸癌的發病率逐漸升高，嚴重威脅著人們的生命健康[1]。目前已經研究發現，淋巴轉移是影響大腸癌患者預后的一個主要因素，淋巴管可作為癌細胞轉移和擴散的主要通道，腫瘤微轉移，特別是淋巴結微轉移逐漸受到臨床重視[2-3]。隨著現代生物學和免疫學檢測技術的發展，最新研究發現，血管內皮生長因子D(VEGF-D)及其受體VEGFR-3的表達與淋巴管的生成密切相關，探討VEGF-D、VEGFR-3與臨床病理參數的關系，研究影響大腸癌淋巴管生成及轉移的機制，對大腸癌臨床分析、預后判斷以及抗癌方法的制定都有著重要的意義[4-5]。因此本次研究特選取本院大腸癌患者83例，分別取其癌標本和癌旁大腸組織，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2014年8月至2016年8月收治的大腸癌患者83例，其中男58例，女25例，年齡47～79歲，平均(63.17±14.68)歲；結腸癌39例，直腸癌46例；腫瘤直徑為1～12 cm，平均(6.57±4.29)cm；潰瘍性生長37例，浸潤型生長33例，腫塊型生長13例；高分化17例，中分化47例，低分化19例；根據Dukes分期：A期19例，B期21例，C期32例，D期11例。納入標準：(1)經腸鏡檢查確診為大腸癌；(2)無消化性潰瘍以及胃腸道手術病史；(3)手術前均未進行任何治療；(4)患者對本次研究知情并簽署知情同意書。排除標準：(1)術前進行過化療治療者；(2)不適宜進行手術者。

1.2方法 每例大腸標本取大腸癌組織及距離癌腫邊緣5 cm，經病理證實無癌細胞殘存的正常腸組織1塊，所有標本在腫瘤切下后1 h內置于液氮中保存。應用流式細胞術與免疫組化法對大腸癌組織和正常組織中的VEGF-D、VEGFR-3的表達進行檢測，VEGF-D、VEGFR-3抗體均購自武漢博士德生物技術有限公司，免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。(1)流式細胞檢測：選取待測的新鮮組織約30 g，用剪刀將組織剪碎，用鑷子將組織物在120目銹鋼網上輕輕搓動，收集搓完后組織，制成1×106個/mL的單細胞原液，取出1 mL原液分別加入VEGF-D、VEGFR-3抗體，操作步驟嚴格按照說明書進行。(2)免疫組化法：根據試劑盒說明滴加一抗VEGF-D、VEGFR-3和生物素化二抗及試劑SABC，用DBA顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片待檢。每張切片觀察10個高倍視野，以細胞中有棕黃色顆粒且染色強度高于背景非特異性著色為陽性細胞。

1.3觀察指標 (1)采用美國BD公司生產的流式細胞儀測定VEGF-D、VEGFR-3水平，以熒光指數(FI)表達VEGF-D、VEGFR-3的相對含量，計算公式：FI=蛋白表達的平均熒光強度-對照樣品平均熒光強度/正常對照樣品平均熒光強度。(2)微血管計數在盲法下進行，每張切片由兩名病理醫師分別進行計數，微血管密度(MVD)的計數根據淋巴管淋巴管內透明質酸受體-1(LYVE-1)、同源異型核轉錄因子(Prox-1)染色結果判斷，LYVE-1、Prox-1陽性的管腔視為淋巴管，先于低倍鏡(40倍和100倍)下確定3個脈管著色最為密集的區域，然后改為200倍視野下計數淋巴管或微血管數目，每例計數5個視野，取其均值作為該病例的微淋巴管密度和微血管密度。正常大腸組織選擇陽性染色脈管最豐富的區域，在200倍視野下分別計算淋巴管和微血管數目，計數5個視野，最后取其均值。LYVE-1、Prox-1的檢測分別應用山羊抗人LYVE-1單克隆抗體和山羊抗人Prox-1單克隆抗體進行免疫組織化學染色。

2 結 果

2.1VEGF-D、VEGFR-3在大腸癌、正常腸組織中的表達 大腸癌組織中VEGF-D、VEGFR-3表達水平較正常大腸黏膜組織顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 VEGF-D、VEGFR-3在大腸癌、正常腸組織中的表達

表2 VEGF-D、VEGFR-3的表達與大腸癌臨床病理特征的關系

2.2VEGF-D、VEGFR-3的表達與大腸癌臨床病理特征的關系 腫瘤直徑<3 cm的大腸癌患者VEGF-D、VEGFR-3水平均顯著低于腫瘤直徑≥3 cm的患者，差異有統計學意義(P<0.05)；浸潤深度未及漿膜患者VEGF-D、VEGFR-3水平均顯著低于浸潤漿膜及以外患者，差異有統計學意義(P<0.05)；Dukes分期為A+B期患者VEGF-D、VEGFR-3水平均顯著低于C+D期患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3微淋巴管密度與VEGF-D、VEGFR-3表達的關系 VEGF-D、VEGFR-3蛋白表達陽性標本其癌旁微淋巴管密度較陰性標本均顯著較高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 微淋巴管密度與VEGF-D、VEGFR-3表達的關系

3 討 論

近年來，我國大腸癌的發病率呈逐年上升趨勢，嚴重危害著人們的生命健康。浸潤與轉移是惡性腫瘤重要的生物學特性，隨著研究的深入人們發現，淋巴轉移是導致癌細胞發生轉移的主要途徑[6-7]。正常的大腸組織的毛細血管管腔較小，且數量較少，而惡性腫瘤周邊的淋巴管密度會顯著增加，淋巴轉移提示著腫瘤的發展，而淋巴管腔的生成是受淋巴管生成因子以及其受體介導和調控的，對淋巴管生成因子及其受體的表達進行探究，對大腸癌患者預后的判斷有著重要意義[8-9]。血管內皮生長因子(VEGF)是內皮細胞中具有特異性的有絲分裂原，具有明顯的促進某些內皮細胞有絲分裂的作用，特別是促進血管的生成[10]。VEGF-D屬于VEGF，是一種重要的淋巴管生成因子，可以作用于淋巴管內皮細胞上與其受體VEGFR-3結合并激活，促進淋巴管內皮細胞的增殖和淋巴管的生成，調控血管以及淋巴管內皮細胞的新生，在腫瘤的生長和轉移方面起著重要的作用[11-12]。VEGFR-3是一種受體絡氨酸激酶，廣泛分布于早期的胚胎血管內細胞上，在胚胎發育后期以及正常的成體中，VEGFR-3只特異性表達在淋巴管內皮細胞中，處于相對靜止的狀態，而一旦機體發生炎性反應或有腫瘤生成，VEGFR-3便會再次被激活與其配體結合，誘導內皮細胞的增殖與遷移[13-14]。

趙云霞等[15]研究者認為，在惡性腫瘤組織中VEGF-D的表達誘導會使VEGFR-3水平上升，并激發VEGFR-3活化，活化后的VEGFR-3介導的信號轉導通路會促使淋巴管生成，導致癌細胞的浸潤和轉移。通過本次研究發現，大腸癌組織中VEGF-D、VEGFR-3表達水平較正常大腸黏膜組織顯著較高，這說明VEGF-D的高表達與大腸癌的生長、轉移有關，VEGF-D、VEGFR-3表達的升高能反應腫瘤預后情況，能繼續促進淋巴管內皮的生長。腫瘤直徑<3 cm的大腸癌患者VEGF-D、VEGFR-3水平均顯著低于腫瘤直徑≥3 cm的患者，浸潤深度未及漿膜患者VEGF-D、VEGFR-3水平均顯著低于浸潤漿膜及以外患者，Dukes分期為A+B期患者VEGF-D、VEGFR-3水平均顯著低于C+D期患者，VEGF-D、VEGFR-3的表達能反應大腸癌臨床病理特征，提示VEGF-D、VEGFR-3參與到了腫瘤的生長、浸潤與轉移。VEGF-D與VEGFR-3相結合，誘導腫瘤內以及腫瘤周邊淋巴管的增生，淋巴管的表面積以及通透性增加，趨化腫瘤細胞進入到淋巴管內，腫瘤細胞通過間質液流動運轉至淋巴管中，最終發生淋巴轉移[16-17]。VEGF-D、VEGFR-3蛋白表達陽性標本其癌旁微淋巴管密度較陰性標本均顯著較高，VEGFR-3與VEGF-D結合后發生磷酸化，使多條細胞內信號傳導通路被激活，淋巴內皮細胞發生增殖分化，新生的淋巴管尚且缺乏連續的基底膜，內皮細胞間的連接較為疏松，且間隙較大，而腫瘤內的淋巴管較為密集，隨著腫瘤的生長，瘤間質滲出物的增加，逐漸向周圍毛細淋巴管擴張，因此腫瘤周邊的淋巴管密度較正常組織更為密集。

4 結 論

在大腸癌發生發展過程中，VEGF-D、VEGFR-3發揮了一定作用。大腸癌中VEGF-D、VEGFR-3可能與腫瘤周邊淋巴管生成相關，其表達上升誘導淋巴管生成。可將VEGF-D、VEGFR-3作為評估大腸癌淋巴結轉移、淋巴管浸潤能力的輔助指標。