云南4種罕見異常血紅蛋白突變型分析*

何建萍，郭薇霞，唐 健，羅勝軍，呂夢欣，黨峰博，林克勤，楊昭慶△

(1.昆明市婦幼保健院遺傳室,云南昆明 650031；2.中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所遺傳室,云南昆明 650118)

血紅蛋白病是由于珠蛋白基因突變導致血紅蛋白結構或合成量異常的最常見的遺傳病，包括異常血紅蛋白病和地中海貧血兩大類[1]。該病分布廣泛，全世界約有7%的人群攜帶血紅蛋白病基因[2]。目前人類血紅蛋白變異體數據庫HbVar(http://globin.bx.psu.edu/hbvar/menu.html)收錄的血紅蛋白突變已經超過了1 300多種,我國報道的已經超過80余種。早期我國大范圍血紅蛋白病調查結果都顯示我國異常血紅蛋白分布以云南發生率最高，達到了6.06%和5.9%[3-4]。目前云南異常血紅蛋白報道較多的是以產生異常條帶E為主的β珠蛋白基因突變HbE(G>A)[5]。本研究通過對7例毛細管電泳檢出的罕見異常血紅蛋白條帶(F、K、J、D)進行分析，確定其突變的基因分子基礎，初步探討罕見基因型與表型的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 獲取到云南省昆明市婦幼保健院進行地中海貧血產前篩查時血紅蛋白毛細管電泳檢出異常血紅蛋白條帶的女性7例。

1.2方法

1.2.1血液學檢查 取乙二胺四乙酸鹽(EDTA)抗凝靜脈血2 mL，采用日本sysmex XT-2000i血細胞分析儀檢測各項血常規指標。血紅蛋白電泳采用歐洲helena V8全自動毛細管電泳儀進行檢測。

1.2.2常見地中海貧血突變基因檢測 采用PCR-反向點雜交法檢測23種中國人常見的地中海貧血基因型(SEA、-α3.7、-α4.2、αCSα、αQSα、αWSα、41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、IVS-I-1M、IVS-I-5M、27/28M、43M、-29M、-30M、31M、-32M、14-15M、IntM和CAPM)。所用試劑為亞能生物技術(深圳)有限公司提供的地中海貧血基因檢測試劑盒。

1.2.3α和β珠蛋白基因片段擴增 采用QIAGEN公司提供的全血試劑盒，嚴格按照說明書進行操作，提取DNA樣本進行PCR，擴增包含啟動子序列及3個外顯子在內的α、β珠蛋白基因序列。引物序列參照文獻[6]，PCR擴增采用TaKaRa LA Taq高保真酶，儀器采用美國ABI公司的9700PCR擴增儀。HBA1、HBA2、HBB基因PCR擴增體系均為30 μL:每一反應體系含2×Mix Buffer 15 μL、上下游引物各0.3 μL、LA Taq 0.2 μL、H2O 11.2 μL、DNA模板含量約100 ng。反應條件為：94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共35個循環，72 ℃延伸20 min。

1.2.4α和β珠蛋白基因片段測序 純化PCR產物后，使用ABI3700測序儀進行測序。

2 結 果

2.1血常規檢測結果 7例樣本血常規參數均為正細胞正色素，無明顯異常。見表1。

表1 4種罕見異常血紅蛋白突變型血液學參數特征

2.2血紅蛋白電泳結果 7例標本共檢出4種異常血紅蛋白電泳條帶：分別為F、K、J、D帶，占總血紅蛋白的含量范圍從38.32%到61.37%。其中代表性的含量異常升高的F帶見圖1。

圖1 Hb San Bruno電泳結果圖(Hb F含量升高)

2.3基因型檢測結果 α和β珠蛋白序列分析檢出4種異常血紅蛋白突變型：1例F帶為Hb San Bruno(HBB:c.120G>C)、2例K帶為Hb New York(HBB:c.341T>A)、2例J帶為Hb J-Bangkok(HBB:c.170G>A)、2例D帶為Hb G-Coushatta(HBB:c.68A>C)。7例異常血紅蛋白均未檢出α、β地中海貧血基因突變。見圖2。

圖2 Hb San Bruno測序結果圖(β珠蛋白基因CD39CAG->CAC雜合突變) ，箭頭示突變

3 討 論

我國異常血紅蛋白分布和發生率具有明顯的遺傳多態性，在我國南方如廣東、廣西地區已報道過Hb Q-Tailand、Hb New York、Hb G-Chinese等多種突變種類[6]。本研究對來本院進行地中海貧血篩查時血紅蛋白電泳檢出異常條帶的7例女性樣本進行了回顧性分析，通過基因檢測確診了4種血紅蛋白的罕見突變，進一步豐富了云南的異常血紅蛋白突變譜。

本研究檢出了1例Hb San Bruno罕見突變。它是β珠蛋白第39位密碼子谷氨酰胺(CAG)突變為組氨酸(CAC)的雜合突變，該突變能產生相對穩定的血紅蛋白。這一突變于2002年HOYER在非洲裔美國女性中首次發現[7]，此后未見相關報道,這是第二例報道，也是我國首次發現該突變，提示該突變在不同種族之間都有分布。本次檢出的這一例Hb San Bruno除了產生占總血紅蛋白含量39%的異常F帶，其他血液學參數無明顯異常，這與美國報道的攜帶者呈小細胞低色素貧血不相符，但是美國的攜帶者呈小細胞低色素貧血是由于該攜帶者合并了子宮肌瘤造成的。研究進一步支持了該突變不會產生臨床表現這一結論。本研究還檢出了2例Hb New York和2例Hb J-Bangkok，分別產生異常K帶與J帶，這與廣西和廣東報道的我國南方常見異常血紅蛋白種類和特點相符[8-9]。此外，本研究檢出了2例Hb G-Coushatta，ZHANG等[10]2017年的時候在566例云南β珠蛋白突變攜帶者中也曾檢出1例，而既往報道顯示Hb G-Coushatta分布以北方人群為主[4]，但近年來，在廣東[11]和江蘇無錫[12]等南方地區都有檢出，提示Hb G-Coushatta在南方人群中也有分布。

本研究檢出的Hb San Bruno、Hb New York、Hb J-Bangkok和HbG-Coushatta血紅蛋白電泳分別產生異常的F帶、K帶、J帶和D帶，其他血液學參數均無明顯異常。這是由于大多數異常血紅蛋白是由于血紅蛋白分子外部氨基酸發生替代突變，這類替代絕大多數不影響血紅蛋白分子的穩定性和功能，因此突變攜帶者通常無臨床表現[13]。盡管本研究檢出的四種罕見突變都不產生臨床表現，但是云南作為異常血紅蛋白發生率最高的地區，曾報道過罕見的血紅蛋白突變型Hb Rush(HBB:c.304G>C)[14]，該突變會產生不穩定的血紅蛋白，能導致溶血性貧血的臨床癥狀，因此在血紅蛋白電泳篩查出異常條帶后，有必要對異常血紅蛋白病進行基因檢測確診。另一方面，云南是除廣州、廣西外的地中海貧血高發地區，α地中海貧血發病率3.18%～9.46%，β地中海貧血發病率1.6%～3.56%[15]，因此這些罕見突變有較高的概率合并地中海貧血，有可能產生更嚴重的血液學表型。有研究報道其他罕見突變類型Hb Gran Via、Hb Macarena和Hb EI Retiro合并α地中海貧血會產生血紅蛋白H病，導致中到重度的溶血性貧血[16]。因此，在云南這樣容易產生異常血紅蛋白和地中海貧血雙重雜合子的地區，當血紅蛋白毛細管電泳檢出異常條帶時，有必要對異常血紅蛋白突變進行基因檢測，積累數據明確其臨床表型和危害性，從而更好地指導遺傳咨詢。

由于異常血紅蛋白病絕大多數無臨床表現，因此往往不能引起人們的重視。但是這些異常血紅蛋白的存在會對糖化血紅蛋白(HbA1c)檢測結果造成干擾[17]。HbA1c是評價糖尿病患者長期血糖控制水平及糖尿病并發癥的重要指標，研究表明利用高效液相色譜法檢測時，Hb J-Bangkok會使HbA1c水平假性降低[18]，而Hb New York會使HbA1c水平假性升高[19]，此時檢測出的HbA1c不能反映患者近2～3個月的血糖控制水平。因此，在像云南這樣異常血紅蛋白發生率高的地區，在應用HbA1c評估糖尿病患者血糖控制狀況時，應先了解患者的血紅蛋白情況，排除因血紅蛋白變異體存在而導致HbA1c臨床應用風險。

4 結 論

本研究報道了中國首例Hb San Bruno罕見異常血紅蛋白突變型，進一步豐富了我國異常血紅蛋白種類。通過對基因型和表型進行探討，絕大多數異常血紅蛋白突變攜帶者沒有任何臨床癥狀，但由于云南是地貧高發區，其合并地中海貧血的臨床意義和危害性還有待于進一步研究。