瀘州地區VDR基因FokI多態性與原發性高血壓的相關性研究*

曹 勇，高婧臻，王曉燕，陳 莊，陳 楓△

(1.西南醫科大學附屬醫院醫學實驗中心，四川瀘州 646000；2.西南醫科大學附屬中醫醫院腎病科，四川瀘州 646000)

高血壓是目前影響人類健康最常見的慢性疾病，可伴有心、腎、腦等器官功能或器質性損害，亦是多種心腦血管疾病的獨立危險因素[1]。國內外的研究證實，降低血壓可以減少15%～30%心肌梗死的發生率及40%～50%的中風發生率[2]。高血壓是基因與環境互相作用的復雜疾病，其病因及具體機制尚未闡明。近年來，維生素D水平與高血壓之間的關系引起廣泛關注，多項研究及調查[3-6]顯示高血壓患者血清中25羥基維生素D[25(OH)D]水平明顯下降，升高血清25(OH)D水平，高血壓的發生率下降，一般認為高血壓發病風險與維生素D呈負相關，而維生素D各種生物學功能實施需通過維生素D受體(VDR)介導。但關于高血壓與維生素D受體相關性的研究較少。基因堿基的改變、缺失、插入，可以影響基因的轉錄水平或活性的增強或降低，高血壓發生可能與VDR基因多態性有關。為此運用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)與DNA測序相結合方式，探究VDR基因多態性與原發性高血壓的關系，為揭示原發性高血壓的發病機制提供分子依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 基于瀘州及周邊地區常住漢族人群，進行常規血液體格檢查及相關問卷調查后，依據2005年中國高血壓治療指南建議的標準[7]，即收縮壓(SBP)≥140 mm Hg或舒張壓(DBP)≥90 mm Hg，或已診斷高血壓正在服降壓藥的患者。高血壓組共415例，其中男性152例，女性263例，平均年齡(63.18±9.19)歲。血壓測量：血壓完成測量1次后，松開臂帶，休息5 min后行下一次測量，共測量3次，取平均值并排除繼發性高血壓。另選取本地血壓正常的健康體檢者為對照組，并排除其他心血管疾病。共415例，其中男性133例，女性282例，平均年齡(62.22±6.27)歲，兩組間年齡和性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)。全部檢測和取樣已征得研究對象同意，個體之間無血緣關系。

1.2方法

1.2.1血液常規檢查 收集空腹靜脈血，分離血清及血凝塊，血清檢測血糖(FBG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、肌酐(Cre)等指標，血凝塊分裝-80 ℃凍存。

1.2.2基因組DNA獲取 DNA的獲取參照莊盟血凝塊試劑盒，NanoDrop光度計測定260、280吸光度值，記錄純度和濃度，放置于-80 ℃保存備用。

1.2.3PCR-RFLP結合DNA測序，檢測VDR基因FokI位點多態性 (1)參考文獻[8]設計引物序列，反向引物：5′-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3′，正向引物：5′-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCT-3，并由上海生工合成。(2)通過PCR反應擴增目的片段：PCR反應試劑(天根生物科技有限公司)，PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，34個循環；72 ℃ 8 min。(3)酶切鑒定：建立20 μL酶切體系，選用FokI限制性內切酶(NEB公司)對PCR 擴增的產物進行酶切，酶切產物采用2.0%瓊脂糖電泳，Goldview染色，觀察并拍照，根據電泳結果確定基因型。(4)測序驗證：隨機選取部分PCR產物測序(Thermo Fisher Scientific公司，上海)驗證。

2 結 果

2.1VDR基因FokI位點基因型分析 VDR基因FokI分型標準：Ff基因型三個片段分別為70 bp、197 bp、267 bp，ff基因型為70 bp、197 bp兩個片段，FF基因型只有267 bp一個片段，其中70 bp片段較小，觀察不清，但不影響實驗結果判定。測序后通過分析軟件核實PCR產物堿基序列，測序驗證結果與酶切結果相符，FokI位點基因型結果見圖1～2。

2.2VDR基因FokI基因型和等位基因分布情況 在VDR基因FokI位點檢測到FF、Ff和ff基因型，3種基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=0.657，P=0.417)。等位基因f、F 頻率在高血壓組和血壓正常組為51.8%、48.2%和48.2%、51.7%，兩者構成比例差異無統計學意義(P>0.05)，而FF、Ff和ff基因型分布差異有統計學意義(P=0.037)，Ff+ff基因型頻率在高血壓組明顯高于正常血壓對照組(69.5%vs. 62.3%)，以FF基因型為對照，Ff+ff基因型發生高血壓的風險增高，OR=1.488(95%CI=1.080～2.052)，見表1。

注：M(50 bp DNA marker);FF基因型(6,8);Ff基因型(3,5，7，9);ff基因型(1，2，4)

圖1 PCR產物FokI酶切后電泳圖

2.3VDR基因FokI位點不同基因型個體與臨床參數的關系 將FokI位點分為FF與Ff+ff基因型，分析臨床參數在不同基因型間的差異，發現TG、Cre在兩種基因型間差異有統計學意義(P<0.05)，SBP水平升高，但差異無統計學意義(P>0.05)，體質量指數(BMI)、DBP、脈率(PR)、FBG、TC、LDL-C、HDL-C兩種基因型間比較，差異均無統計學意義(P<0.05)，見表2。

圖2 VDR基因FokI測序結果

基因型正常血壓組[n(%)]高血壓組[n(%)]基因型和等位基因比較OR(95%CI)PFF115(27.7)85(20.5)Ff+ff vs. FF1.488(1.080～2.052)0.015Ff199(48.0)229(55.2)ff vs. FF+Ff1.000(0.728～1.373)1.000ff101(24.3)101(24.3)ff vs. FF1.353(0.913～2.005)0.132F429(51.8)399(48.2)f401(48.2)431(51.8)f vs. F1.156(0.953～1.401)0.141

表2 VDR基因FokI不同基因型與臨床參數關系

2.4logistic回歸分析 以是否患高血壓為因變量，對有統計學意義的3個變量(TG、Cre和FokI多態性)，進行非條件logistic回歸分析，結果顯示FokI多態性、TG、Cre是高血壓發生獨立的危險因素，見表3。

表3 高血壓發生相關危險因素的logistic回歸分析

3 討 論

VDR在不同的細胞類型、組織和器官中被發現，包括那些通常與體內鈣平衡及骨代謝不相關的細胞，這表明VDR除了調節體內鈣平衡，可能也參與了其他重要的生物過程。VDR基因包括8個內含子和9個外顯子，目前報道多態性位點有ApaI、BsmI、FokI和TaqI，其中FokI多態性能夠編碼不同長度的蛋白質[9]，所以在所有VDR基因多態性位點中，FokI位點最具潛在功能。最近研究也顯示VDR基因FokI多態性與多種疾病的發生發展密切相關[10-13]。

本次研究分析瀘州地區高血壓組和血壓正常兩組間VDR基因FokI位點基因型和等位基因分布，發現高血壓和正常血壓組間基因型FF、Ff 和ff分布具有統計學意義(P<0.05)。將基因型FF作為參照，Ff+ff基因型的個體發生高血壓的風險增高，OR=1.488(95%CI=1.080～2.052)。與LI等[14]研究皮膚黑色素瘤與VDR多態性相關性，發現Ff+ff基因型能提高皮膚黑色素瘤發病風險(OR=1.26,95%CI=1.00～1.59)和ABD-ALLAH等[15]發現Ff+ff能增加Ⅰ型糖尿病發病風險一致。與WANG等[16]在美國男性人群發現ff基因型能增加高血壓風險和SWAPNA 等[17]研究印度人群VDR基因FokI多態性與高血壓相關性，FF基因型能增加高血壓風險不一致。不同人群之間，由于遺傳、地理、環境等因素的不同，VDR基因多態性分布可能存在一定的差異。進一步分析不同基因型的血壓水平，相對于FF基因型，Ff+ff基因型收縮壓水平升高，但未見統計學差異，可能是樣本量不足，造成統計學上未見明顯的差異。同時也探究了高血壓發生可能的危險因素，經logistic回歸分析發現FokI多態性、TG、Cre是高血壓發生獨立的危險因素，與朱旭明等[18]、洪卓周等[19]發現TG、Cre水平有助于預測原發性高血壓的發生一致。

不同區域的多態性對VDR基因表達影響各異，FokI為5′端第二個外顯子上的第一個起始密碼子ATG的T-C變異形成，此區一旦發生突變，可能影響人VDR蛋白質的功能。雷紅等[20]研究顯示，與維吾爾族、漢族對照組比較，維吾爾族、漢族高血壓組VDR mRNA表達較低。最新研究顯示VDR基因FokI多態性與25(OH)D水平存在相關性[21-23]，夏盛隆等[24]探究維生素D受體基因多態性及血清25(OH)D水平與潰瘍性結腸炎的關系，經logistic回歸分析中發現血清25(OH)D缺乏與FokI突變基因型(Ff/ff)之間存在交互作用。當體內維生素D缺乏時，可能通過腎臟中腎素基因的表達、影響血管內鈣穩態、調節平滑肌細胞和內皮細胞功能來調節高血壓。推測FokI多態性可能改變VDR基因表達和蛋白活性，影響了血清中的維生素D水平，進而引起血壓的改變。由于本次研究未檢測維生素D血清水平和VDR表達水平，不能闡述FokI多態性能否可以改變VDR基因表達，影響維生素D水平。為此下一步將結合維生素D血清水平、VDR基因FokI位點不同基因型VDR表達水平及活性等情況進一步分析FokI多態性如何參與高血壓的發生。

4 結 論

綜上分析，認為VDR基因FokI多態性與原發性高血壓發生易感風險有關，而原發性高血壓的發生并不是單一基因突變引起的，可能由多基因位點突變共同參與的過程。但通過測定人群中特定基因型可有效評估高血壓發生風險，對臨床高血壓的防治具有重要的指導意義。