肺炎支原體抗體金標法聯合降鈣素原、超敏C反應蛋白檢測快速診斷支原體肺炎*

涂海霞，韓忠燕，徐麗云，蔡 嘯，李 妍

(南京醫科大學附屬逸夫醫院病理與臨床檢驗中心，江蘇南京 210000)

肺炎支原體肺炎(MPP)可以發生在所有年齡段，但以兒童和青少年發病率最高。肺炎支原體(MP)感染是兒童社區獲得性肺炎(CAP)的重要病原之一，約占兒童CAP 的10%～30%[1-2]。其主要臨床表現為發熱和咳嗽，缺乏特異性的病征，對于患兒的早期確診和治療產生很大的影響[3-4]。部分患兒還會繼發出現肺不張、肺纖維化等嚴重疾病，所以早期診斷MPP以便臨床能夠及時對患兒做出正確有效的處理至關重要。血清學檢測是臨床普遍使用的MP抗體檢測方法，現通過被動凝集法、金標法、間接免疫熒光法對治療前血清中的MP-IgM進行檢測，比較3種方法的靈敏度、特異度。目前臨床上使用的MP快速金標法檢測技術應用較為廣泛，但由于其較高的漏檢率一直無法為臨床提供有效精確的診斷。此外，近些年，涌現出很多感染性疾病檢測指標，比如降鈣素原(PCT)、白介素-6(IL-6)、超敏C反應蛋白(hs-CRP)、C反應蛋白(CRP)等，它們均在MP感染疾病發生時，有直接或者間接的改變[5-8]。本文旨在對以上指標進行檢測，通過logistic回歸分析和受試者工作特征曲線(ROC曲線)下面積(AUC)計算尋找有效的疾病診斷和預測指標，為臨床提供有效幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年9-12月來本院就診且診斷為MPP的患兒68例作為觀察組，所有患兒均符合MPP的診斷標準:發熱、咳嗽；胸部X線檢查提示雙肺點、片狀炎性浸潤陰影；白細胞大多正常；青霉素類藥物治療無效、大環內酯類藥物治療有效，且間接免疫熒光法測定MP-IgM抗體均為陽性。其中男33例，女35例，年齡0～9歲，平均(3.5±1.9)歲。同時選取同期來本院進行體檢的健康兒童63例作為對照組，其中男性35 例，女性28 例；年齡0～8歲，平均(3.9±1.6)歲。兩組的年齡進行正態性分析，屬非正態分布數據(P<0.05)，再行K-S檢驗，差異無統計學意義(P=0.236)；性別經Fisher精確檢驗，兩組間比較，差異無統計學意義(P=0.213)，具有可比性。

1.2儀器與試劑 使用Roche E411發光分析儀、Roche Cobas 8000 C701生化分析儀、Sysmex XN-BN3血球儀、德沃CRP分析儀、EUROStar Ⅲ Plus熒光顯微鏡(德國)。CRP試劑盒：德沃公司試劑；PCT、IL-6、hs-CRP 試劑盒:羅氏診斷公司PCT、IL-6、hs-CRP 試劑；WBC試劑盒：希森美康公司試劑；MP-IgM抗體檢測試劑盒：日本賽樂迪亞-麥可Ⅱ MP-IgM抗體檢測試劑盒(被動凝集法)、麗珠MP-IgM抗體檢測試劑盒(金標法)、德國歐蒙呼吸道病原體譜抗體IgM檢測試劑盒(間接免疫熒光法)。

1.3方法

1.3.1標本采集及處理 使用陽普黃色干燥管采集靜脈血2 mL，3 000 r/min 離心5 min分離血清，立刻-80 ℃凍存，用于測定血清的IL-6、hs-CRP、PCT水平；使用陽普紫色EDTA-K2抗凝管采集靜脈血500 μL，直接測定血常規和CRP。

1.3.2指標檢測 使用Roche E411發光分析儀檢測PCT、IL-6；使用Roche Cobas 8000 C701生化分析儀檢測hs-CRP；使用Sysmex XN-BN3血球儀檢測血常規；使用德沃CRP分析儀檢測CRP；使用賽樂迪亞-麥可Ⅱ測試劑盒、麗珠檢測試劑盒、德國歐蒙呼吸道病原體譜檢測試劑盒血清MP-IgM；所有步驟按照試劑盒說明書進行操作。

1.4統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，對數據進行正態性檢驗，年齡、PCT、IL-6、hs-CRP、CRP數據屬于非正態分布，以中位數(四分位數間距)[M(P25,P75)]表示，組間比較采用兩獨立樣本非參數檢驗方法K-S檢驗進行統計分析，靈敏度、特異度使用McNemar′s-Test。正態分布指標WBC進行t檢驗觀察差異，定性指標性別和金標結果進行Fisher精確檢驗統計分析。行逐步logistic回歸分析得到預測概率新變量并作ROC曲線，獲得曲線下面積(AUC)等診斷效能參數。評價MP抗體金標法和PCT、IL-6、hs-CRP、CRP、WBC單項和聯合檢測對MPP的診斷價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.13種方法靈敏度、特異度比較 3種MP-IgM檢測方法結果比較分析顯示，被動凝集法的靈敏度、特異度分別為80.9%、79.4%；金標法分別為77.9%、88.9%；間接免疫法分別為98.7%、88.9%。經NcNemar′s-Test分析，金標法和間接免疫熒光法相比，特異度的差異無統計學意義(P>0.05)，靈敏度差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3種檢測方法靈敏度、特異度比較(%)

注：與金標法比較，*P<0.05

2.2兩組血清MP抗體、IL-6、hs-CRP、PCT及全血WBC和CRP檢測結果比較 將觀察組與對照組血清或全血中IL-6、hs-CRP、PCT、WBC和CRP進行K-S檢驗，其中IL-6、hs-CRP、PCT、CRP呈非正態分布(P<0.05)，WBC呈正態分布(P>0.05)，非正態分布數據再進行K-S檢驗，正態分布數據進行t檢驗，定性結果進行Fisher精確檢驗，結果顯示，MP抗體、IL-6、hs-CRP、PCT及CRP差異具有統計學意義(P<0.05)，WBC差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3逐步logistic回歸分析各變量 以MP抗體(金標法)、IL-6、hs-CRP、PCT和CRP的檢測結果為檢驗變量，疾病與否為狀態變量，用向前法作logistic 回歸，所有指標均與疾病密切相關(P<0.05)，對各指標進行篩選，剔除IL-6、CRP指標，保留MP(金標法)、PCT、hs-CRP建立了logistic回歸模型，并分析產生聯合預測變量1：MP(金標法)+ PCT和聯合預測變量2：MP(金標法)+ PCT+ hs-CRP兩種預測變量，對回歸模型進行似然比檢驗，與單項檢測相比，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 兩組血清MP抗體、IL-6、hs-CRP、PCT及全血WBC和CRP檢測結果比較

表3 逐步logistic回歸分析各變量

2.4各指標單獨檢測、聯合檢測逐步logistic回歸分析預測變量的ROC曲線分析 以hs-CRP、PCT、金標法、金標法+PCT、金標法+PCT+hs-CRP 為檢驗變量，診斷結果為狀態變量，作ROC 曲線分析，結果顯示，hs-CRP、PCT、金標法單獨診斷MPP的曲線下面積(AUC)分別為0.809(95%CI：0.731～0.872)、0.989(95%CI：0.953～0.999)、0.834(95%CI：0.759～0.893)，均有一定的診斷價值(P<0.05)。其中PCT的診斷效能最大，靈敏度和特異度分別達到94.1%和96.8%，hs-CRP和金標法的特異度達到了90.5%和88.9%，但是靈敏度分別僅為70.6%和77.9%，效能略差。金標法+PCT聯合診斷MPP的AUC為0.996(95%CI：0.994～1.000)，靈敏度95.6%,特異度98.4%；而金標法+PCT+hs-CRP聯合診斷MPP的AUC為0.998(95%CI：0.994～1.000)，靈敏度97.1%,特異度98.4%；兩種聯合預測變量沒有統計學差異(P>0.05)，見表4、圖1。

表4 hs-CRP、PCT、金標法和預測變量金標法+PCT、金標法+PCT+hs-CRP 對MPP的預測效能分析

圖1 各指標單獨及聯合檢測的ROC曲線

3 討 論

MP屬于柔膜體綱支原體科支原體屬，是有能力在體外不依靠活細胞生存并能自我復制的最小微生物之一，其特點是缺乏肽聚糖細胞壁、具有和宿主相互作用的絲狀尖端結構[9-10]。研究表明MP是引起社區獲得性呼吸道感染的主要病原體之一，可引起支氣管炎和非典型肺炎[11]。MPP治療時常規的青霉素類抗菌藥物治療是無效的，且療程長，通常需要2～3周。如不早期診斷，更會延誤病情，并發肺不張、肺纖維化等嚴重并發癥，此外還會出現肺外并發癥，如腦炎等[12]。MP感染的臨床癥狀和體征缺乏特異性，給臨床診斷帶來一定困難，實驗室早期、快速、明確檢測MP感染對臨床盡早、合理用藥至關重要。

目前MP檢測主要依靠支原體培養、血清學檢測、分子檢測等等手段。支原體培養作為MP檢測的金標準[9]，因其耗時長且陽性率低導致其在MP早期檢測中應用嚴重受限；而近期流行的分子檢測，由于儀器操作設備要求高、操作繁瑣也一直未被廣泛使用[13]；所以在臨床應用較多的仍然是血清學檢測，一方面因為MP感染時，潛伏期為2～3周，當患者出現癥狀而就診時，IgM抗體已達到相當高的水平，因此，IgM抗體陽性可作為急性期感染的診斷指標[13]；另一方面，血清學檢測具有快速簡便的操作優勢。

目前，MP的血清學檢測有3種方法，分別是被動凝集法、金標法、間接免疫熒光法。3種方法中，間接免疫熒光法有最高的靈敏度和特異度，被動凝集法最低且操作較為復雜；金標法的靈敏度稍低，為77.9%，而特異度和間接免疫熒光法一致，為88.9%，且檢測快速，僅需20 min即可判讀結果，快速診斷潛在價值較高。

IL-6被證實可通過受體與糖蛋白130(gp130)激活Janus激酶-信號轉導子與轉錄激活子(JAK-STAT)、絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)等信號通路在炎癥和免疫調節中發揮重要的生物學效應[14-16]；血清PCT是降鈣素前肽物質，在CAP中明顯升高，且與疾病的發展呈現一定的相關性[17]；而CRP和hs-CRP也一直被認為是感染時會明顯升高的急性時相反應蛋白[7]。但是由于巨大的個體差異和方法學的限制，僅僅通過單獨的檢測指標對MPP診斷有一定的局限性，并導致一定的誤診和漏診，而聯合檢測可能在一定程度上能彌補這一不足。

本研究在證實MPP組與對照組在金標法陽性率和IL-6、PCT、CRP、hs-CRP水平存在明顯差異的基礎上，運用logistic回歸對以上所有指標包括WBC進行逐步篩選，雖然觀察組IL-6水平顯著高于對照組，但是其與CRP和WBC在模型計算中被剔除了，而金標法、PCT和hs-CRP被保留了，而且通過ROC曲線分析，三者聯合診斷的AUC達到了0.998。

需要指出的是：(1)WBC雖被模型剔除，但是在MPP中，其陰性的指示意義是較大的，因為該指標在排除細菌性肺炎時有一定的價值；(2)雖然IL-6是公認的炎癥因子且觀察組IL-6水平顯著上升，其25%分位和75%分位值分別是6.17 pg/mL 和22.56 pg/mL，但其診斷效能不如PCT，即在MP診斷時，同時選擇IL-6和PCT是沒有必要的，應優先選擇PCT；(3)hs-CRP雖然被模型保留，但其與金標法和PCT聯合較金標法與PCT聯合并未發生顯著差異，提示hs-CRP對模型有較好的修正意義，但是可能由于樣本量過少，導致差異并無統計學意義；(4)CRP被剔除，說明CRP在MP的診斷中的意義并不是太大，臨床中并非必查指標，如果一定要查，應考慮選擇hs-CRP；(5)被保留的三項指標金標法、PCT和hs-CRP的全部檢測出報告時間可以壓縮在1 h內，大大提高了診斷效率；(6)聯合檢測后，聯合指標的靈敏度和特異度由之前金標法單用時的77.9%、88.9%提高至95%以上，升高顯著。

4 結 論

綜上所述，MP抗體金標法聯合PCT和hs-CRP檢測對MP感染的診斷效能顯著提高，且檢測時間明顯縮短，有較大的臨床經濟性和實用性。此外，聯合檢測在本研究中無假陽性，但仍需在大樣本研究中進一步評價其假陽性率，而在臨床工作中，結合影像等結果以及臨床經驗進行具體分析和考慮，也有望進一步提高MPP的診斷準確性。