西地那非對先天性膈疝大鼠胎肺中HIF-2α和VEGF-A表達的影響及意義

馮 威，侯 昉，劉文英△，張利兵，陳文科，蔣 琴，賈紅慧

(1.電子科技大學醫學院/四川省人民醫院兒童醫學中心小兒外科，成都 610072;2.成都市婦女兒童中心醫院小兒外科一病區 610074)

先天性膈疝(congenital diaphragmatic hernia,CDH)是由于膈肌缺損，導致腹腔臟器、器官疝入胸腔，從而引起一系列病理生理變化的一種先天性疾病，在新生兒中的發病率為1∶2 500～1∶3 000[1]。盡管產前診斷及臨床手術治療的水平不斷提高，但根據全球多個醫療中心數據顯示，CDH病死率仍高達20%～60%[2]。迄今仍無有效治療手段從根本上改變CDH合并的肺發育不良和肺動脈高壓，這是其存活率不能改善的重要原因[3]。

國外學者研究發現西地那非可以改善CDH患兒肺發育不良[4]，有利于CDH動物模型胎肺毛細血管新生及肺泡的發育[5]。實驗表明缺氧誘導因子-2α(HIF-2α)和血管內皮生長因子-A(VEGF-A)在胎肺發育過程中起著重要作用。因此本實驗擬通過對除草醚誘導的大鼠膈疝模型進行產前西地那非干預，研究胎肺中HIF-2α、VEGF-A蛋白表達的變化情況，探討其改善肺發育不良可能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 成年Sprague-Dawley大鼠(電子科技大學醫學院/四川省人民醫院實驗動物研究所提供)：雌鼠20只，雄鼠10只，體質量 220～300 g，平均(269.7±24.8)g，實驗前均未曾交配。

1.2儀器與試劑 除草醚(浙江化工二廠)、枸櫞酸西地那非片(美國輝瑞制藥有限公司)；VEGF-A蛋白兔多克隆抗體(英國Abcam公司)、HIF-2α蛋白兔多克隆抗體(英國Abcam公司)、GAPDH蛋白鼠單克隆抗體(美國Gene Tex公司)、ECL發光試劑盒(美國Thermo公司)、二抗生物素化山羊抗兔、抗鼠IgG(英國Abcam公司)、Image Lab凝膠分析系統(美國Bio-Rad公司)、ChemiDoc XRS+ Systems凝膠掃描成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1動物模型建立及分組 雌雄鼠按2∶1分籠，晚間定時配種，次日上午取雌鼠陰道分泌物涂片于顯微鏡下觀察，以發現精子為配種成功依據，確定為懷孕0.5 d。10只孕鼠按隨機數字表法分為正常空白組(NC組)2只；正常西地那非組(NS組)2只；模型空白組(MC組)3只；模型西地那非組(MS組)3只。孕9.5 d時，模型組6只孕鼠灌胃給予除草醚125 mg/只(溶于1 mL橄欖油)，正常組4只給予等量橄欖油。孕11.5～20.5 d，西地那非干預組5只孕鼠每天灌胃西地那非8 mg/只(溶于2 mL生理鹽水中)，空白組5只大鼠每天給予等量生理鹽水。

1.3.2肺組織標本采集 孕21 d,所有孕鼠行戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后剖宮取出胎鼠，稱量胎鼠體質量(Bw)后斷頭處死，經胸骨正中切口剖開胸腔，完整取出兩側肺組織并稱質量(Lw)，將胎肺組織從支氣管分叉處分成左右兩肺，各取部分肺組織即刻放入10%中性甲醛和-70 ℃低溫環境保存備用。將去除肺組織的胎鼠置于(4倍)放大鏡下,經頭側仔細觀察有無膈肌缺損,逐一記錄有無膈疝、膈疝的位置、膈肌缺損的大小及疝內容物，分析比較各組胎鼠肺發育情況。

1.3.3肺組織形態學觀察 將固定于10%甲醛中的肺組織于24 h內石蠟包埋，行常規切片及蘇木素-伊紅(HE)染色，在Olympus BX51光學顯微鏡下觀察，BA200Digital數碼三目攝像顯微攝像系統圖像采集，Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測量以下肺實質、血管的發育情況。(1)平均終末支氣管密度(MTBD)：100倍視野下計數10個互不重疊視野內終末支氣管個數。終末支氣管的數目與環繞每個終末支氣管的腺泡數成反比，因此肺組織結構越成熟，MTBD越小[6]。(2)肺泡間隔：200倍視野下測量互不重疊的3個視野下10～15個肺泡間隔的厚度。(3)平均肺泡面積：200倍視野下測量互不重疊的5個視野內10～15個肺泡的平均面積。(4)肺泡面積百分比(PAA%)：200倍視野下測量互不重疊的5個視野內的肺泡面積比。(5)小血管個數：200倍視野下計數5個互不重疊視野內直徑30～70 μm的血管個數。(6)血管中膜厚度(medial wall thickness，MWT):200倍視野下每張切片測量至少3根含有平滑肌層、形態規則的直徑小于70 μm肺小動脈的如下指標，血管外徑(external diameter，ED)、血管內徑(internal diameter，ID)，MWT=(ED-ID)/2,MWT是評估肺血管重構情況的指標[7]。

1.3.4免疫組織化學染色 每組隨機選擇8個樣本采用SP法分別檢測HIF-2α、VEGF-A蛋白在胎肺組織中的表達，以PBS(pH 7.2～7.4)替代一抗作為空白對照，以染色呈淺黃色或棕黃色為陽性，藍色為陰性。BA200Digital數碼三目顯微攝像系統采集肺組織圖像，在400倍視野下選取2個互不重疊的視野，并使用Image-Pro Plus6.0軟件分析測定陽性染色顆粒的平均光密度(AOD)。

1.3.5Western blot 各組取等重量的冰凍組織解凍后用勻漿器研磨均勻，加入細胞裂解液，按照BCA Protein Assay Kit 說明書提取各組肺組織蛋白并測定蛋白濃度，按每孔蛋白量100 μg上樣后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白轉移至聚二偏氟乙烯(PVDF)膜上，將PVDF膜放入稀釋的TBST封閉液中2 h,洗膜后加入一抗(HIF-2α蛋白抗體1∶500稀釋；VEGF-A蛋白抗體1∶500稀釋，內參GAPDH蛋白抗體1∶5 000稀釋)4 ℃孵育過夜，再次洗膜后加入二抗(山羊抗兔、抗鼠IgG 1∶5 000稀釋)孵育2 h,洗膜后顯影、定影、拍照，Image Lab系統分析各組蛋白條帶表達量并計算相對灰度值(目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值)。

2 結 果

2.1實驗動物一般情況及胎肺的觀察 10只孕鼠共收獲胎鼠113只，其中NC組27只，NS組19只，均無膈疝形成；MC組收獲胎鼠38只，膈疝致畸率為60.53%(23/38)，MS組收獲胎鼠29只，膈疝致畸率為72.41%(21/29)，疝內容物主要為肝、胃及小腸等，兩組致畸率差異無統計學意義(P>0.05)。MC組Lw/Bw較NC組顯著降低(P<0.01)，MS組與MC組比較差異無統計學意義(P=0.76)，NS組與NC組比較差異無統計學意義(P=0.19)，見表1。

表1 模型誘導情況及肺組織觀察

*:P<0.01,與NC組比較

2.2組織形態學檢查 各組肺組織發育情況見圖1，對各項測得的觀察指標進行統計分析發現，與NC組相比較，MC組胎肺中MTBD、肺泡間隔及MWT均顯著升高(P<0.01)，平均肺泡面積、PAA%、小血管個數、血管內徑均減小(P<0.01)；與NC組比較，MS組MTBD、肺泡間隔及MWT均降低(P<0.01)，平均肺泡面積增大(P<0.05)，小血管個數顯著增多、血管管腔增大(P<0.01)；NS組相比于NC組除小血管個數有所減少(P<0.05)，其余指標間差異均無統計學意義(P>0.05)。具體統計數據見表2、表3。

2.3免疫組織化學染色圖像分析 HIF-2α陽性染色主要位于肺泡上皮細胞的細胞核及支氣管上皮細胞胞質和細胞膜，而在血管組織細胞中表達較少(圖2)；VEGF-A則廣泛表達于血管內皮細胞、支氣管上皮細胞及肺間質細胞的細胞質中，少量表達于血管平滑肌細胞，見圖3。HIF-2α蛋白與VEGF-A蛋白陽性表達平均光密度呈正相關(r=0.463，P<0.01)。

表2 各組肺泡及支氣管發育指標檢測

*：P<0.05、**：P<0.01，與NC組比較；#：P<0.05、##：P<0.01，與MC組比較

表3 各組肺小血管發育指標檢測

*：P<0.05、**：P<0.01，與NC組比較；#：P<0.05、##：P<0.01，與MC組比較

A：NC組；B：NS組；C：MC組；D：MS組

圖1肺組織切片形態學觀察(HE×100)

A：NC組；B：NS組；C：MC組；D：MS組

圖2胎肺組織HIF-2α免疫組織化學染色光鏡觀察(×200)

A：NC組；B：NS組；C：MC組；D：MS組

圖3胎肺組織VEGF-A免疫組織化學染色光鏡觀察(×200)

圖4 HIF-2α、VEGF-A蛋白在各組胎肺組織中的表達情況

**:P<0.01

圖5 HIF-2α蛋白在各組胎肺中表達情況比較

2.4Western blot 定量檢測HIF-2α、VEGF-A蛋白的表達情況 HIF-2α、VEGF-A蛋白在各組胎鼠肺組織中表達情況見圖4。MC組HIF-2α相對表達水平(0.557±0.383)與NC組(1.474±0.305)和MS組(1.195±0.035)相比均降低，差異有統計學意義(P<0.01)，NC組與NS組(0.970±0.288)比較，差異無統計學意義(P=0.076)；VEGF-A在NC組和MS組中相對表達水平分別為(1.026±0.156)和(1.019±0.157)，與MC組(0.646±0.026)相比均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，NC組和NS組(0.885±0.294)差異無統計學意義(P=0.374)，見圖5、6。

*:P<0.05

圖6 VEGF-A蛋白在各組胎肺中表達情況比較

3 討 論

肺動脈高壓合并肺發育不良是CHD最主要的病理特征，本研究通過在顯微鏡下對比CDH模型胎鼠與正常胎鼠肺組織發育情況證實了以上觀點，即模型組胎肺肺泡塌陷不均勻，有效通氣面積大幅減小，肺泡間隔增厚，終末支氣管增多，肺細小血管數量顯著減少，血管病理性重構明顯，管徑減小，管壁增粗，存在明顯肺發育不良及肺動脈高壓的表現。

西地那非是磷酸二酯酶-5(PDE5)的選擇性抑制劑，最早研究用于心絞痛的治療，其后由于意外發現的血管舒張作用有治療陰莖勃起不良(erection dysfunction,ED)的特效而被人們所熟知，其可在神經末梢和內皮細胞釋放出的NO與平滑肌受體結合，激活細胞內鳥苷酸環化酶(GC)，并在錳離子(Mn2+)參與下促進環磷酸鳥苷(cGMP)生成,cGMP通過活化鈣離子(Ca2+)泵使細胞內Ca2+濃度降低，從而使血管舒張，血流增多。已經證實西地那非的作用機制正是通過選擇性抑制PDE5對 cGMP的降解作用，使細胞內cGMP水平升高，增強NO的舒張血管作用[8]。后來研究者發現西地那非同樣能作用于肺血管舒張而有效地緩解肺動脈高壓，并且合適的治療劑量不會對其他系統造成明顯的不良反應[9]，現已成為臨床上治療肺動脈高壓的可選擇藥物[10]。近年來，國外研究者們將西地那非用于治療CHD的研究中，發現產前西地那非干預能緩解肺動脈高壓[3],對CDH肺血管的發育有一定的促進作用[11]，但具體的作用機制尚不清楚。本研究發現西地那非產前干預并沒有降低CDH的發生率，但通過產前西地那非干預的胎鼠肺泡平均面積增大，間隔變薄，終末支氣管明顯減少，肺泡間微小血管數量增多，血管腔增大，管壁明顯變薄，較CDH模型小鼠胎肺發育明顯改善，提示西地那非對胎肺成熟和緩解肺動脈高壓有明顯的促進作用，而對正常孕鼠進行西地那非干預后觀察到，除對肺血管有一定的舒張作用外，對胎鼠胎肺的發育沒有產生明顯的影響。

目前研究發現多種細胞因子參與了胎肺的發育過程，其中HIF-2α和VEGF-A的表達可能在肺血管重構、新生血管形成及肺泡、細小支氣管的發育過程中起著重要的作用[12-13]。HIF是細胞對低氧環境反應的重要的異源二聚體轉錄因子，研究發現在HIF-2α基因缺失的小鼠中VEGF-A表達明顯降低并且引發了嚴重的肺發育不良[14],GIATROMANOLAKI等[15]在對皮膚血管瘤的研究中發現HIF-2α異常升高可以上調VEGF-A的表達從而引起血管內皮細胞迅速增殖，促進了血管的快速生成。HUANG等[16]研究發現HIF-2α在胎鼠胚胎發育末期表達顯著增高有利于肺泡Ⅱ型細胞分泌表面活性物質，降低肺泡表面張力，促進肺泡成熟。眾所周知，VEGF在血管發育過程中起著重要的調節作用，許多研究發現，VEGF作為多條細胞信號傳導通路的下游調節靶向基因，直接參與了肺血管的增殖和分化。然而VEGF家族成員眾多，且在不同疾病的組織中表達的特點各不相同，有研究發現在除草醚誘導的CDH動物模型胎肺中VEGF-A mRNA呈低表達[17],陳中獻等[18]也在研究漢防己甲素干預對CDH胎肺發育影響中發現TET通過上調VEGF蛋白表達促進肺泡周圍毛細血管發育;然而SHEHATA等[19]在對死于嚴重的CHD肺動脈高壓的新生兒肺的研究中發現VEGF表達卻異常增高，OUE等[20]也在除草醚誘導的CHD胎鼠模型中發現VEGF表達有升高。因此VEGF在CHD肺發育過程中表達尚待進一步研究。

本實驗免疫組織化學結果顯示，HIF-2α、VEGF-A蛋白在肺泡、細支氣管、微血管上均有不同程度的表達，且在膈疝MC組中表達明顯弱于NC組，結合肺組織形態學觀察可以說明，HIF-2α、VEGF-A蛋白的表達異常降低與肺發育不良和肺動脈高壓的形成有密切的關系，而通過西地那非干預后，其陽性表達均明顯增強，并且兩因子表達變化趨勢呈正相關。隨后應用Western blot技術對HIF-2α、VEGF-A蛋白在各組胎肺中的表達進行定量檢測，其結果與免疫組織化學觀察到的表達變化趨勢基本一致，即與NC組相比，HIF-2α、VEGF-A蛋白在MC組中表達明顯降低；而在MS組中表達則高于MC組。因此本組實驗研究提示，對除草醚誘導的大鼠CDH模型產前使用西地那非進行干預，可以促進肺泡發育和血管新生，改善肺組織結構，緩解肺動脈高壓，推測可能是通過上調HIF-2α、VEGF-A蛋白的表達實現的。當然，由于在低氧條件下HIF-2α蛋白是VEGF-A的上游誘生因子，因此西地那非也可能在缺氧環境下發育不良的肺內通過增強HIF-2α蛋白表達來上調VEGF-A蛋白表達，VEGF-A蛋白作用于肺血管促進了血管內皮細胞分裂增殖，誘發更多的血管新生，減小血管中膜厚度，維持血管正常的完整形態，增強了血管通透性，而肺內血流循環的改善促進了肺泡的發育[21]；另一方面 HIF-2α蛋白也可直接作用于肺泡上皮細胞，促進肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌肺表面活性物質，減少肺表面張力，有利于肺泡發育成熟[16]。

綜上所述，本實驗證實了西地那非對改善CHD組織發育的具有促進作用，并推測西地那非可能通過直接或間接地上調HIF-2α、VEGF-A蛋白的表達來協同促進肺小血管及肺泡的成熟。然而西地那非具體是如何作用于其靶向調節基因還不明確，國外文獻報道可能有更多的細胞因子參與了西地那非的調節機制[22-23]，因此還需要更加深入的研究明確。