羅格列酮對高脂血癥性胰腺炎大鼠腎小管上皮細胞凋亡的影響

王 睿，閆兆鵬，吉凱強，吳興茂，臧 彬△

(中國醫科大學附屬盛京醫院：1.重癥醫學科；2.普外科，沈陽 110004)

高脂血癥是急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)的危險因素之一,也是繼膽源性、酒精性之后AP的常見病因,AP與高脂血癥的并存率為12%～38%[1]。過去在我國AP的發病因素以膽道疾病為主，占50%以上。近年來隨著生活水平的提高和飲食結構的改變，高脂血癥性胰腺炎(hyperlipidemic pancreatitis，HP)的發病率呈上升趨勢，HP本身及其并發癥的發病機制的探索及治療手段的開發也開始引起人們更多的關注。HP可以引起與其他類型胰腺炎相同的并發癥[2]，并有證據證明HP導致的并發癥更為嚴重，發病率更高。腎功能障礙在重癥胰腺炎(SAP)中的發生率為14%～43%，僅次于肺功能障礙[2]。急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是導致SAP死亡的常見原因之一，病死率高達71%～84%[3]。另外，脂代謝紊亂也對腎臟損傷有著促進作用，因此HP并發的AKI很可能較單純SAP誘發的AKI更為嚴重。然而該并發癥的病理表現和分子機制目前并沒有文章報道。

PPARγ激動劑作為胰島素增敏劑被用于2型糖尿病的治療。研究表明，其代表藥物羅格列酮(RSG)能夠有效緩解牛磺膽酸鈉(sodium taurocholate，sTCA)誘導的AP癥狀，減輕炎性反應[4],并能夠改善AP并發的肺損傷[5]。本研究擬采用高脂飲食聯合牛磺膽酸鈉逆行胰膽管注射方法，建立HP大鼠模型，觀察HP并發AKI的病理特點，并在此基礎上探討羅格列酮對腎小管上皮細胞凋亡的作用及其調控機制。

1 材料與方法

1.1主要藥品與試劑 牛磺膽酸鈉(T4009-250MG)和羅格列酮(R2408-50MG)購自美國Sigma公司,大鼠腎損傷分子1(Kim-1)檢測試劑盒和NGAL檢測試劑盒購自美國Uscn公司，In Situ Cell Death Detection Kit 購自上海羅氏公司，抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2動物分組及模型制備 36只清潔級健康雄性SD大鼠，8周齡，體質量180～200 g，購自中國醫科大學實驗動物中心[動物合格證號：SCXK(遼)-2013-0001]。本實驗中動物實驗方案符合動物倫理學標準。按隨機數字表法將大鼠分為正常飲食對照組(Normal組)；正常飲食+逆行胰膽管注射5%牛磺膽酸鈉組(AP組)；高脂飲食組(HFD組)；高脂血癥性胰腺炎組(HP組)；正常飲食+羅格列酮組(N+RSG組)和高脂血癥性胰腺炎+羅格列酮組(HP+RSG組)，每組6只。HFD、HP組和HP+RSG組大鼠給予高脂飼料喂養4周(高脂飼料配方為87.8%基礎飼料+10%豬油+2%膽固醇+0.2%膽酸鈉)，Normal、AP組和N+RSG組給予正常飼料喂養4周。飼養4周后行逆行胰膽注射法建立大鼠AP模型，術前禁食、不禁水12 h，以保證腸道條件一致。以2 mL/kg(100 mg/kg)5%氯胺酮+10 mg/kg甲苯噻嗪腹腔注射麻醉后固定、腹部脫毛、消毒、鋪無菌巾；沿腹正中線作1.5 cm 切口，AP、HP組和HP+RSG組經上腹劍突下正中切口進腹，切口2～3 cm，顯露肝下間隙，暴露十二指腸，將十二指腸翻出體外。暴露胰腺，確認胰膽管及十二指腸乳頭位置，以血管夾阻斷近肝門處胰膽管，用BD密閉式靜脈留置針(規格24 G，批號383408)于十二指腸乳頭附近經十二指腸腸壁穿刺進入腸腔，經乳頭逆行刺入胰膽管，進入約5 mm，確認針頭已進入胰膽管后，在十二指腸乳頭處用另一血管夾夾畢、固定。使用微量注射泵將5% sTCA溶液按1 mL/kg用量注入胰膽管內，以0.2 mL/min的速度注射完畢，保持壓力5 min后除去血管夾，逐層關腹。其余各組采用逆行胰膽管注射生理鹽水。所有動物術后立即皮下注射生理鹽水10 mL抗休克，之后將動物放回飼養籠中，待麻醉清醒后可自由活動、進食、飲水。造模后24 h后，HP+RSG組和N+RSG組經腹腔注射10 mg/kg羅格列酮，其余組給予等體積溶劑。48 h后處死各組大鼠，心尖取血離心留血清及取材腎組織，用于后續實驗。

1.3血清生化檢測 取6組大鼠血清，送中國醫科大學附屬盛京醫院檢驗科用采用全自動生化分析儀檢測血清淀粉酶(AMY)活性、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)水平；檢測血清肌酐(Scr)、尿素氮含量(BUN)。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測早期AKI標記物尿KIM-1，血清及尿液中的NGAL水平。

1.4大鼠腎臟組織 標本常規脫水、透蠟、包埋、切成5 μm的薄片，行PAS染色，于顯微鏡下觀察染色效果。于400倍鏡下拍照，行PAS半定量評分，依據皮質腎小管上皮細胞壞死百分比評分：0分為無壞死；1分為壞死面積小于10%；2分為壞死面積10%～25%；3分為壞死面積>25%～75%；4分為壞死面積大于75%。電鏡下觀察腎臟超微結構變化。電鏡標本取厚度小于1 mm的組織，2.5%戊二醛固定，1% 鋨酸-0.1 mmol/L二甲胂酸鈉緩沖液固定，脫水，丙酮浸透、包埋、聚合，制成1 μm厚半薄切片。 日立(H-7650)透射電子顯微鏡下觀察，拍片。

1.5TUNEL染色檢測大鼠腎臟組織凋亡情況 依照試劑盒說明書，石蠟切片常規脫蠟、水化，加TUNEL反應液，再加入轉化劑-POD，然后DAB顯色，于400倍光學顯微鏡觀察并計數。TUNEL 陽性表達率= 陽性表達細胞數/細胞總數×100%。

1.6Western blot檢測大鼠腎臟Bax、Bcl-2及cleaved-caspase-3等相關凋亡蛋白表達 取腎臟組織，加入等體積RIPA裂解液，冰浴下超聲破碎制成組織勻漿液，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液，BAC法測定蛋白濃度，蛋白樣本凝膠電泳分離后，轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜室溫封閉1 h，加入一抗(β-actin抗體為1∶5 000，其他抗體為1∶1 000) 4 ℃孵育過夜，羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，滴加增強化學發光色液后于化學發光成像儀內曝光顯影，用凝膠圖像處理系統(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標條帶的光密度值。

2 結 果

2.1實驗動物一般情況 飼養期間各組大鼠無死亡，手術造模過程順利，各組大鼠全部存活至術后48 h。Normal、HFD、N+RSG組大鼠的術后恢復較快，4～6 h后可活動、飲水，生命狀態平穩。AP、HP組大鼠的一般情況最差，術后精神萎靡，平臥休息，有呼吸急促、弓背豎毛寒戰、動作呆滯等應激表現，少數大鼠腹部切口周圍可見黃色滲出。HP+RSG干預組的大鼠不同程度地出現以上應激癥狀，但較HP組都有明顯改善，活動、飲水、精神狀況等有所好轉。

2.2實驗動物的大體解剖觀察 普通飼料喂養組(Normal、N+RSG組)大鼠，肝臟呈暗紅色，邊緣銳利；高脂飼料喂養組(HFD、HP、HP+RSG)大鼠肝臟可見黃色條紋，邊緣變鈍，腹腔大網膜脂肪組織較多。Normal組大鼠胰腺無充血水腫，腎臟顏色暗紅，未見明顯異常。個別大鼠胰腺組織稍有水腫，可見少量淡黃色腹腔積液。AP、HP組腹腔內存在大量血性腹腔積液，胰組織胰腺體積較Normal組增大、包膜緊張，部分區域可見液化、出血、壞死等改變；有鈣化斑附著，腎臟暗紅色，無明顯腫脹。HP+RSG組可見大量黃色腹腔積液，胰組織胰腺體積增大、包膜緊張，部分可見液化、出血、壞死等改變；有鈣化斑附著，腎臟暗紅色，無明顯腫脹。

2.3組織病理學檢查

2.3.1PAS染色腎小管間質損傷 PAS染色結果見圖1，Normal組及N+RSG組大鼠腎小管排列整齊，結構完整，腎小球及腎間質未見明顯異常。HFD組腎小管基底面增厚，少量炎癥細胞浸潤。 AP、HP組可見腎小管間質水腫，炎癥細胞浸潤，腎小管基底面脫落、皺縮、部分小管上皮壞死，失去原有形態，另HP組可見腎小管上皮細胞空泡變性。HP+RSG組腎組織的上述損傷減輕。行PAS染色半定量評分結果見圖2A，與Normal組比較，AP、HFD、HP組腎小管損傷指數明顯增高(P<0.01)；與AP組相比，HP組損傷指數增高(P<0.01)；與HFD組相比，HP組損傷指數增高(P<0.01)；與HP組相比，HP+RSG組損傷指數降低(P<0.01)。

2.3.2電鏡下觀察腎臟超微病理變化 電鏡下可見高脂飲食組(HFD、HP組)腎小球基底膜(GBM)增厚,足細胞內皮細胞孔增大，足細胞足突變形,排列異常,內皮細胞孔變大或不清。HP組可見內皮孔隙消失，足突大部分融合，結構紊亂，部分濾過膜薄厚不均勻，足突寬度明顯增加，大部分可見融合。HP+RSG組足細胞結構不完整，體積增大，部分可見融合，并有微絨毛形成，病變較HP組減輕，見圖1。

2.3.3TUNEL染色檢測大鼠腎臟組織凋亡情況 TUNEL染色顯示(圖1)，陽性細胞核呈棕黑色，Normal、N+RSG組大鼠腎臟偶見凋亡細胞，AP 、HFD、HP、HP+RSG組有不同程度的凋亡，凋亡細胞以腎小管上皮細胞為主，腎小球細胞見少量凋亡。凋亡率反映細胞凋亡的程度，顯微鏡下觀察并計數凋亡率:每張切片從不同的10個視野計數100個細胞/視野，計算出凋亡率(圖2B)。結果顯示:Normal、N+RSG組可見個別散在的細胞發生凋亡；與Normal組比較，AP、HFD、HP、HP+RSG各組凋亡細胞明顯增多,凋亡率顯著增加(P<0.01)，以HP組最為顯著；與HP組比較，HP+RSG組凋亡細胞明顯減少,凋亡率顯著降低(P<0.01)。

2.4大鼠血清生化檢測結果 各組大鼠的AMY活性、TG、總膽固醇(TC)、HDL、LDL測定結果見表1。與Normal組相比，AP、HFD、HP組血清淀粉酶明顯增高(P<0.01)，與Normal組相比AP、HFD、HP組血脂系列(TG、TC、HDL、LDL)明顯增高(P<0.01)。 與HP組相比，HP+RSG組血清淀粉酶明顯降低(P<0.01)，HP+RSG組血脂系列(TG、TC、HDL、LDL)明顯降低(P<0.01)。各組大鼠的血清尿素氮、肌酐測定結果見表2。與Normal組相比，AP、HFD、HP組Scr水平明顯增高(P<0.01)，與HP組相比HP+RSG組Scr水平明顯下降(P<0.01)。與Normal組相比，AP、HFD、HP組血清BUN水平明顯增高(P<0.01)，與HP組相比HP+RSG組BUN水平明顯下降(P<0.01)。

表1 各組大鼠血清生化結果

▲：P<0.01，與Normal組比較；△：P<0.01，與HP組比較

2.5ELISA檢測尿KIM-1，NGAL表達 ELISA法檢測尿KIM-1，NGAL水平，與Normal組相比，AP、HFD、HP組KIM-1水平明顯增高(P<0.01)，NGAL水平明顯增高(P<0.01)，見表2。

2.6Western blot檢測大鼠腎臟Bax、Bcl-2及cleaved-caspase-3等相關凋亡蛋白表達 Western-blot 檢測顯示(圖2)，Bax條帶出現在23×103，Bcl-2條帶出現在26×103，cleaved-caspase-3條帶出現在17×103,β-actin出現在43×103，灰度分析顯示：與 Normal組比較，AP、HFD、 HP組Bax和cleaved-caspase-3在腎組織中表達明顯升高(P<0.01)，而Bcl-2卻顯著下降(P<0.01)；經羅格列酮干預后HP+RSG組較HP組Bax和cleaved-caspase-3表達下降(P<0.01)，而Bcl-2表達卻明顯上調(P<0.01)。

表2 各組大鼠尿NGAL、KIM-1水平

▲：P<0.01，與Normal組相比

1：PAS染色腎小管間質損傷，Normal組(1A)及N+RSG組(1E)大鼠腎小管排列整齊，結構完整，腎小球及腎間質未見明顯異常；HFD組(1C)腎小管基底面增厚，少量炎癥細胞浸潤；AP組(1B)、HP組(1D)可見腎小管間質水腫，炎癥細胞浸潤，腎小管基底面脫落、皺縮、部分小管上皮壞死，失去原有形態，另HP組可見腎小管上皮細胞空泡變性；HP+RSG組(1F)可減輕腎組織的上述損傷。2：電鏡下觀察腎臟超微病理變化Normal組(2A)腎小球濾過膜結構基本正常，基膜均勻完整、無增厚；內皮細胞空隙明顯，分布均勻；足細胞結構完整，足突寬度正常，均勻排布于基膜外側；細胞質密度均勻，細胞器完整。AP 組(2B)：基膜均勻完整、無增厚；內皮細胞空隙明顯，分布均勻；足細胞結構不完整，部分足突寬度明顯增加，部分可見融合，并有微絨毛形成；HFD組(2C)足細胞結構尚完整，部分足突寬度明顯增加，部分可見融合，并有微絨毛形成。HP組(2D)可見內皮孔隙消失，足突大部分融合，結構紊亂，部分濾過膜薄厚不均勻，足突寬度明顯增加，大部分可見融合；HP+RSG組(2F)足細胞結構不完整，體積增大，部分可見融合，并有微絨毛形成。3：TUNEL染色檢測大鼠腎臟組織凋亡情況，TUNEL染色陽性細胞核呈棕黑色，Normal組(3A)、N+RSG(3E)組大鼠腎臟偶見凋亡細胞，AP、HFD、HP、HP+RSG組有不同程度的凋亡，凋亡細胞以腎小管上皮細胞為主，腎小球細胞見少量凋亡

圖1各組大鼠腎組織PAS染色、電鏡、TUNEL染色結果

A:PAS染色半定量評分；B：TUNEL染色腎組織凋亡率；C：凋亡相關蛋白Western blot結果；D：凋亡相關蛋白Western blot結果分析；*:P<0.01,與Normal組相比；#：P<0.01，與HP組相比

圖2病理染色半定量評分結果及凋亡相關蛋白Westernblot結果

3 討 論

近年來隨著人們生活水平的提高和飲食習慣的改變，由高TG血癥誘發的HP逐年增多，其臨床表現除特征性的乳糜血外，常伴有嚴重的代謝紊亂，并發急性肺損傷、急性腎損傷等器官功能障礙，預后差，且易復發。HP患者發生AKI的機制尚未完全明確，可能與HP時細胞因子、炎癥介質的大量釋放，腎臟血流動力學及微循環障礙，中晚期腸道細菌移位，內毒素作用加重腎臟損傷等相關。近期研究表明：腎細胞的凋亡也在HP腎損傷中起到重要作用。

本研究選取HP腎損傷動物模型，前期實驗證實HP大鼠早期有腎損傷發生，早期腎損傷標記物，如尿KIM-1、NGAL等均升高(P<0.01)。尿KIM-1是一種敏感性和特異性都較高的早期診斷腎小管損傷的標記物[3]。缺血早期近端腎小管上皮細胞大量表達KIM-1,尿KIM-1表達在缺血后12 h即可檢測出,并持續升高數天。腎近曲小管細胞在損傷后可高表達NGAL,在動物及人體研究中均發現腎臟缺血損傷2 h后，血清及尿液中的NGAL明顯升高,NGAL水平越高,腎臟損傷越重,臨床預后越差。這些結果表明，本研究的HP模型中早期便存在急性腎損傷。

進一步對大鼠腎組織進行病理分析，行PAS染色，HP組病變主要集中在腎小管內膜部位，半定量評分顯示HP組腎小管損傷指數明顯增高，羅格列酮干預可減輕HP腎小管損傷程度。TUNEL染色檢測大鼠腎臟組織凋亡情況，TUNEL染色顯示HP組腎臟有不同程度的凋亡，凋亡細胞以腎小管上皮細胞為主。與HP模型組比較，羅格列酮干預可顯著降低腎組織凋亡率，筆者推測抑制凋亡可能可以修復損傷。

細胞凋亡即程序性細胞死亡，是細胞遵循自身程序自己結束其生命的主動死亡方式，由精確的基因調控執行。細胞凋亡是組織正常發育及重構的關鍵因素，在HP腎損傷的發生、發展過程中同樣有重要的意義。本實驗通過TUNEL原位檢測各組大鼠腎組織證實HP大鼠腎組織存在細胞凋亡。細胞凋亡在腎功能下降及腎臟病理損傷中發揮了一定的作用。細胞凋亡受多種凋亡相關基因及其蛋白的調控，與凋亡相關的基因通常分為抗凋亡基因和促凋亡基因。Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白，而Bax為 Bcl-2家族成員，其作用為促凋亡。caspase-3 是半胱氨酸蛋白酶家族的重要成員,是各種凋亡途徑下游的必經之路,被認為是執行細胞凋亡最關鍵的蛋白酶。caspase-3 一旦被激活,凋亡的發生不可避免,故又稱細胞凋亡的終末剪切酶[7]。caspase-3活化會激活DNA斷裂因子,導致失活狀態下的核酸內切酶激活,降解多聚聚合酶和核纖層蛋白等，引起染色體斷裂,造成細胞凋亡[8]。抑制caspase酶活性可能成為防治HP腎損傷的關鍵環節[9]。

羅格列酮在不同種類細胞的凋亡過程中起到不同的作用，羅格列酮通過調節氧化應激、內質網應激和炎性反應，可抑制胰腺β細胞、骨骼肌細胞、肝細胞和神經元細胞的凋亡[10-13]。本實驗研究結果顯示，應用羅格列酮治療后可使HP腎損傷過程中凋亡指數下降，Bcl-2 表達增強，Bax表達減弱，它可抑制HP誘發AKI過程中腎臟凋亡的發生，且其腎臟保護作用與抑制 Bcl-2/Bax，capases-3介導的細胞凋亡密切相關，與文獻[14]報道一致。

本實驗觀察羅格列酮通過減少腎小管上皮細胞凋亡減輕高脂血癥胰腺炎所導致的腎損傷，為今后研究打下一定基礎，但實驗存在一定局限，未進行相關凋亡蛋白mRNA水平的檢測，及進一步細胞信號通路的深入探討。另針對膿毒癥腎損傷的研究顯示，自噬能夠拮抗細胞凋亡，對LPS介導的腎小管上皮細胞損傷發揮保護作用，抑制自噬作用能夠加重LPS介導的AKI。今后本課題組將繼續就自噬在HP所導致的腎損傷中的功能及具體機制作進一步探索。

綜上所述，羅格列酮能降低高脂血癥胰腺炎大鼠腎臟Bax、caspase-3表達,增加Bcl-2的表達，減少腎小管上皮細胞凋亡，保護腎臟。