人腦膠質(zhì)瘤組織中神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)蛋白8的表達(dá)及其意義*

曾凡濤，王新軍，楊 卓，王修成，楊如意，周少龍，張旭陽(yáng)，袁小威

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，鄭州 450052)

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，患者生存期短、病死率高、預(yù)后差[1]。神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)蛋白8(NEDD8)是一種類(lèi)泛素蛋白，與泛素約有60%的氨基酸序列相同，80%同源，主要在心肌和骨骼肌中特異性表達(dá)[2]。NEDD8和底物相結(jié)合，參與翻譯后可逆性修飾的過(guò)程稱(chēng)為Neddylation，即NEDD化。該修飾可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的多種代謝途徑，其異常將導(dǎo)致人類(lèi)神經(jīng)退行性疾病和腫瘤的發(fā)生[3-4]。目前已有相關(guān)研究報(bào)道NEDD8蛋白在肺癌[5]、肝內(nèi)膽管癌[6]及結(jié)腸癌[7]中異常高表達(dá)，但其在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況卻較少報(bào)道。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法和Western blot檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中NEDD8的表達(dá)及分布，并初步探討NEDD8的表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年3月至2015年3月于本院神經(jīng)外科手術(shù)治療的89例膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤組織及瘤周組織，獲取標(biāo)本后保存于-80 ℃冰箱內(nèi)。其中，WHO分級(jí)Ⅰ級(jí)16例，Ⅱ級(jí)39例(少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤14例)，Ⅲ級(jí)20例(少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤10例)，Ⅳ級(jí)14例。納入標(biāo)準(zhǔn)：首發(fā)病例；鏡下手術(shù)全切除；術(shù)前未接受放、化療及其他治療。本研究均已獲得患者家屬同意及本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1主要試劑和儀器 兔抗人NEDD8單克隆抗體購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；二抗反應(yīng)增強(qiáng)液、二抗增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔免疫球蛋白G(IgG)聚合物及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自美國(guó)Milipore公司；熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)NEDD8表達(dá) 89例標(biāo)本在離體后經(jīng)10%甲醛固定，行常規(guī)石蠟包埋等處理，將包埋標(biāo)本以3 μm厚度連續(xù)切片，置于防脫劑預(yù)處理后的載玻片上。滴加NEDD8抗體(稀釋比為1∶100)于4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜；磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后添加反應(yīng)增強(qiáng)液、增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG復(fù)合物，DAB顯色液鏡下顯色觀察；蘇木素復(fù)染，清水返藍(lán)后中性樹(shù)膠封片，于鏡下觀察。以PBS液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.2.3Western blot檢測(cè) 取冰凍組織標(biāo)本250 mg，剪碎后放入勻漿器中，加入預(yù)冷的蛋白裂解液1 mL，在冰上勻漿30 min，使蛋白質(zhì)充分裂解；將勻漿后的液體倒入1.5 mL EP管中，煮沸5 min后10 000 r/min離心。將離心后的上清液析出，在冰上分裝至200 μL的EP管中，置于-70 ℃冰箱保存。二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離樣品后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉4 ℃封閉過(guò)夜。加入兔抗人NEDD8抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，加入羊抗兔二抗(1∶10 000)37 ℃孵育1 h。采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，測(cè)定各條帶的吸光度值。將每個(gè)標(biāo)本測(cè)得的NEDD8條帶吸光度值與內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)條帶吸光度值相比，所得比值代表該標(biāo)本中NEDD8蛋白的表達(dá)水平。

1.2.4結(jié)果判斷 由本院兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師采用雙盲法閱片和雙評(píng)分半定量法進(jìn)行評(píng)分，光鏡下觀察8個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)NEDD8陽(yáng)性細(xì)胞。其中以陽(yáng)性細(xì)胞百分比小于或等于25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。按染色程度評(píng)分：無(wú)染色者為0分，淡黃色者為1分，黃色或棕黃色者為2分，褐色者為3分。最后以?xún)烧咴u(píng)分總和為最終評(píng)分結(jié)果：0分為陰性，1～7分為陽(yáng)性，其中1～3分為低表達(dá)，4～7分為高表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1NEDD8在腦組織中的表達(dá)和分布 NEDD8在腫瘤組織細(xì)胞核中高度表達(dá)，而在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)相對(duì)較弱，可見(jiàn)黃色或棕黃色的陽(yáng)性顆粒物質(zhì)(圖1)。NEDD8蛋白水平在瘤周組織中為0.11±0.02，在腫瘤組織中為0.43±0.06，WHO低病理級(jí)別(Ⅰ、Ⅱ)中為0.32±0.14，高病理級(jí)別(Ⅲ、Ⅳ)中為0.52±0.08，瘤周組織與腫瘤組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-9.801，P=0.001)，WHO低病理級(jí)別與WHO高病理級(jí)別比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-6.684，P=0.003)，見(jiàn)圖2。NEDD8表達(dá)分布情況見(jiàn)表1。

表1 NEDD8在不同級(jí)別和不同組織中的表達(dá)(n)

表2 腫瘤組織中NEDD8蛋白的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系(n)

a：采用連續(xù)性校正χ2檢驗(yàn)

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織和瘤周組織中NEDD8的表達(dá)

2.2NEDD8的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 NEDD8的表達(dá)與WHO分級(jí)、腫瘤直徑有相關(guān)性(P<0.05)，與患者性別、年齡、膠質(zhì)瘤成分及腫瘤部位無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表2。

1：瘤周組織；2：腫瘤組織；3：低病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織；4：高病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織；GAPDH：對(duì)照內(nèi)參

圖2 Western blot檢測(cè)腦組織中NEDD8蛋白水平

3 討 論

NEDD8是由NEDD8基因編碼的由81個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多肽，又稱(chēng)Rub1，在大多數(shù)真核生物中廣泛表達(dá)，高度保守，在細(xì)胞功能的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用[8]。NEDD化是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾途徑，通過(guò)該途徑，NEDD8與底物蛋白結(jié)合可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能，此過(guò)程中涉及3種酶：激活酶E1、結(jié)合酶E2及連接酶E3[9]。目前已知NEDD8修飾的主要底物是cullin家族，該蛋白家族可作為cullin-RING泛素連接酶(CRLs)的分子骨架[10]，且在多種人類(lèi)癌癥中發(fā)現(xiàn)CRLs的亞基存在著過(guò)表達(dá)、突變或者擴(kuò)增等現(xiàn)象。已有研究表明，NEDD化途徑過(guò)度激活將會(huì)導(dǎo)致人類(lèi)惡性實(shí)體瘤的進(jìn)展[5-7]；此外，NEDD8通路的抑制因子MLN4924也已顯示出了較好的抗腫瘤特性[11]。

人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)的病理性改變過(guò)程。由于內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜，人腦膠質(zhì)瘤在臨床上的治療效果不容樂(lè)觀。在腫瘤細(xì)胞中，蛋白質(zhì)主要參與增殖、遷移等重要活動(dòng)并為腫瘤的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[12]。目前已有少量研究報(bào)道NEDD化過(guò)度激活有可能與膠質(zhì)瘤(Ⅳ級(jí))組織的惡性程度相關(guān)聯(lián)[13]，此外，腫瘤組織中NEDD8蛋白的高表達(dá)也提示了患者預(yù)后不良。

本研究顯示，NEDD8在腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)為79.8%(71/89)，明顯高于瘤周組織中的35.9%(32/89)，這提示NEDD8可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。NEDD8在WHO高病理級(jí)別中的陽(yáng)性表達(dá)為97.1%(33/34)，明顯高于WHO低病理級(jí)別中的69.1%(38/55)，本研究還通過(guò)檢測(cè)不同WHO病理級(jí)別中的蛋白水平，更加明確了NEDD8蛋白在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)，且隨著腫瘤WHO病理級(jí)別的升高而升高，這與文獻(xiàn)[13]報(bào)道情況基本一致，這表明NEDD8可能在膠質(zhì)瘤的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。由于大多數(shù)膠質(zhì)瘤與周?chē)M織分界不明顯，術(shù)中難以保證對(duì)腫瘤做到全切除[14]，這可能導(dǎo)致膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)，因此，NEDD8蛋白的表達(dá)程度是否可作為快速判斷腫瘤邊界的定量指標(biāo)，對(duì)臨床一線(xiàn)醫(yī)生后續(xù)手術(shù)全切膠質(zhì)瘤有重要意義。此外，本課題組發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組織中NEDD8的表達(dá)與患者WHO病理分級(jí)、腫瘤直徑有關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤細(xì)胞成分及腫瘤部位無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。NEDD8的表達(dá)隨著腫瘤直徑的增大而增加，可能是腫瘤組織中NEDD8蛋白經(jīng)NEDD化抑制Cullins與CAND1的相互作用，促進(jìn)了Cullin與接頭蛋白和底物識(shí)別亞基的結(jié)合，增強(qiáng)CRLs的生物活性，從而加速了腫瘤的生長(zhǎng)和增殖[15]。據(jù)此，本研究假設(shè)NEDD8表達(dá)水平的增高促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別及體積的改變，NEDD8蛋白可能有望作為判斷膠質(zhì)瘤生物學(xué)特征的分子新靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究初步分析了NEDD8蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，為研究膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)機(jī)制、侵襲進(jìn)展提供了理論依據(jù)和參考。然而，NEDD8蛋白的異常表達(dá)是通過(guò)何種途徑來(lái)增強(qiáng)膠質(zhì)瘤的生物活性目前尚未明了。接下來(lái)本課題組將進(jìn)行NEDD8參與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的機(jī)制研究，并對(duì)腫瘤患者術(shù)后進(jìn)行隨訪(fǎng)，進(jìn)一步探討NEDD8與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系。