咖啡因在高氧誘導早產仔鼠肺損傷中的修復作用研究*

鄧 萌，宋亞楠，程 宇，李 青，張 翔，王 歡，吳凱峰，劉曉麗，鄭興惠，黃 波△

(1.遵義醫科大學第三附屬醫院PICU，貴州遵義 563000；2.遵義醫科大學研究生院，貴州遵義 563000)

早產兒出生時肺部發育不成熟，常需要氧氣支持和機械通氣治療。然而，長期暴露在高氧環境極易造成氧化應激，形成肺纖維化，使肺部發育遲緩，最終導致支氣管肺發育不良(BPD)[1]。細胞外信號調節蛋白激酶(ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族中重要成員之一，參與基因表達，細胞增殖、凋亡等重要生命過程[2]。大量研究顯示，高氧條件下可以觸發ERK途徑[3-5]。咖啡因通常用于治療早產兒的呼吸暫停[6-7]，一項回顧性研究發現咖啡因在預防支氣管肺發育不良(BPD)中有非常重要的功效[8]。然而，咖啡因的肺保護作用機制目前尚不清楚。本研究以早產 Wistar 大鼠為研究對象，復制高氧肺損傷動物模型，觀察咖啡因干預后肺纖維化情況， ERK的分布及蛋白表達，并分析咖啡因干預對早產鼠高氧肺損傷修復的作用及其與MAPKs/ERK信號通路的關系，以期為臨床指導用藥及綜合治療BPD提供重要的臨床及理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康成年Wistar大鼠[揚州大學比較醫學中心，許可證號：SCXK(蘇)2012-0004]32只，其中雄性8只，雌性24只，體質量200～250 g。分為8組，每組雌鼠和雄鼠按3∶1合籠交配，第2天上午8:00查見陰栓記為妊娠第1天，將孕鼠分籠并于妊娠第19天時行剖宮產取出早產鼠。

1.1.2主要試劑 牛血清清蛋白(BSA，德國Roche公司)；抗兔/鼠通用型免疫組織化學試劑盒[Real EnvisionTMHRP (rabbit/mouse)，丹麥Dako公司]；Phospho-p44/42(pErk)兔多克隆抗體(美國Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1實驗動物及分組 8窩(72只)早產大鼠出生12～24 h內聚攏，分配給代母鼠并分為4組，即空氣+9 g/L鹽水組(A+N組)、空氣+咖啡因組(A+C組)、高氧+9 g/L鹽水組(H+N組)、高氧+咖啡因組(H+C組)，每組18只。

1.2.2高氧模型復制 H+N組和H+C組持續暴露于高氧中，A+C組和H+C組予腹腔注射咖啡因29 mg·kg-1·d-1，A+N和H+N組每天腹腔注射同等體積的9 g/L鹽水。代母鼠每24小時在4組之間更換1次，以避免氧中毒，同時排除不同組間代母鼠影響。高氧暴露在自制氧箱內完成，氧流量5 L/min，連續檢測氧濃度(CYS-1數字測氧儀，上海嘉定電子儀器廠)，使氧濃度維持于60%～70%。早產大鼠高氧、空氣暴露14 d，室溫維持在24～25 ℃ ，晝夜各12 h，自由進食進水，每天開箱15 min進行清掃，無水氯化鈣和生石灰吸收水蒸氣和二氧化碳并每天更換。

1.2.3肺組織收集與制備 于早產仔鼠出生后3、7、14 d，各組選取6只進行取材，3.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔麻醉大鼠，開胸并結扎右肺，剪開左心耳，右心室注入含肝素的生理鹽水，直到左心耳流出的液體清亮為止，分離心、肺。

1.2.4肺組織指標檢測 留取左中肺組織，經4%多聚甲醛固定，常規進行切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織形態學改變。在100倍光鏡下進行輻射狀肺泡計數(RAC)，每張切片計數5次，取平均值。肺濕重/干重(W/D)測定：右肺取部分組織稱濕重后置80 ℃溫箱，48 h后稱肺干重，計算肺W/D值。

1.2.5各組肺組織膠原纖維含量檢測 采用Masson染色法，NikonDSRil偏振光顯微鏡下觀察4組仔鼠各時間點的膠原纖維分布情況。每張切片選取5個視野，采用病理圖文分析系統測試陽性細胞倍數(陽性細胞倍數=陽性細胞數/總細胞數×100%)。

1.2.6免疫組織化學檢測磷酸化ERK(p-ERK)在肺組織中的分布 脫蠟,水化組織切片，3%H2O2孵育5～10 min，將切片浸于0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液熱修復抗原，5%BSA封閉20 min，滴加pERK抗體(1∶250)，4 ℃過夜。滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG，1∶1 000)，37 ℃ 孵育20 min。二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片。結果判定：胞核和(或)胞質呈現棕黃色即為陽性細胞。

1.2.7Western blot檢測肺組織p-ERK蛋白表達水平 各組分別提取肺組織總蛋白，用BCA法進行蛋白質定量，再采用Western blot方法檢測肺組織p-ERK蛋白表達水平，經發光、曝光、顯影后分析結果，內參蛋白為β-actin，以蛋白灰度值進行統計分析。

2 結 果

2.1各組肺組織病理學觀察 A+N組、A+C組3 d時肺泡結構不規則，肺泡腔小，肺泡間隔較厚；H+N組、H+C組3 d時可見肺泡內少量紅細胞及液體滲出，偶見炎性細胞和肺水腫表現。A+N組、A+C組7 d時肺泡結構逐漸清楚，無液體和炎性滲出，肺泡間隔變薄。H+N組、H+C組7 d時肺泡壁增厚，肺組織結構紊亂，肺間質細胞增加，肺泡內大量紅細胞及液體滲出，炎性細胞增多。A+N組、A+C組14 d時肺泡結構逐漸清楚，無液體和炎性滲出，肺泡間隔變薄。H+N組、H+C組14 d時炎性滲出減少，肺間質增厚并伴隨纖維化，見圖1。

圖1 各組3、7、14 d時肺組織病理結構(HE染色，×200)

圖2 各組3、7、14 d時肺組織p-ERK蛋白分布(Masson染色，×200)

2.2各組肺RAC、W/D、膠原纖維含量比較 第3天，H+N組的RAC較A+C組明顯降低(P<0.05)。H+N組、H+C組的膠原纖維含量與A+N組、A+C組比較明顯提高(P<0.05)，H+N組的膠原纖維含量較H+C組更高(P<0.05)。第7、14天，H+N組、H+C組的RAC、W/D值和膠原纖維含量與A+N組、A+C組比較差異有統計學意義(P<0.05)，H+N組、H+C組的RAC降低，W/D值和膠原纖維含量增高；與H+C組比較，H+N組RAC更低，W/D值和膠原纖維含量更高(P<0.05)，見表1。

2.3各組肺組織p-ERK蛋白分布 免疫組織化學檢測結果表明，p-ERK蛋白陽性反應產物在細胞質表達，為棕黃色顆粒狀。與A+N組、A+C組比較，高氧暴露3、7、14 d時H+N組肺組織p-ERK平均光密度值均增加，差異有統計學意義(P<0.05)。而H+C組p-ERK平均光密度值較H+N組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2～3。

表1 各組肺組織RAC、W/D值、膠原纖維含量比較

a：P<0.05，與A+N組比較；b：P<0.05，與A+C組比較；c：P<0.05，與H+N組比較

2.4各組肺組織p-ERK蛋白水平 Western blot結果表明，各組在3個不同的時間段ERK蛋白水平無明顯差異(圖4B)。高氧暴露第3天、第7天和第14天時，p-ERK蛋白水平在H+N組中明顯升高，與A+C組、A+N組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，其中在第7天水平最高；在高氧暴露第7天和第14天時，H+C組中的p-ERK蛋白水平降低，與H+N組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4C。各組p-ERK/ERK比值與p-ERK蛋白水平情況表現出相同的趨勢，見圖4D。

圖3 各組3、7、14 d時肺組織p-ERK的平均光密度值

A：ERK、P-ERK、β-actin蛋白灰度條帶；B：4組ERK灰度值與β-actin灰度值的比值柱形圖；C：4組p-ERK灰度值與β-actin灰度值的比值柱形圖；D：4組p-ERK/ERK蛋白相對表達量柱狀圖

圖4 各組ERK和p-ERK蛋白在肺組織中的表達

3 討 論

隨著醫療技術的發展，氧療及機械通氣的應用使早產兒存活率明顯提升，但過度或高濃度的氧氣治療極易導致BPD發生。近年來BPD在存活的早產兒中發生率為60%以上,嚴重影響兒童的生存質量甚至導致其死亡。拮抗氧化應激，抑制肺組織纖維化被認為是減少BPD發生的重要因素，因此本研究擬對咖啡因干預早產鼠高氧肺損傷修復的作用及機制進行研究。本課題組選用妊娠19 d破宮產仔鼠作為實驗動物，暴露于高氧環境后，其組織學變化模擬了早產兒的BPD[9]。通過病理切片發現，A+N組與A+C組中，肺組織隨著時間延長逐漸發育；高氧暴露7 d時，H+N組肺泡壁增厚，肺組織結構紊亂，肺間質細胞增加，肺泡內大量紅細胞及液體滲出，炎性細胞增多，隨著高氧暴露時間的延長，H+N組肺間質增厚并伴隨纖維化；咖啡因干預后，這一現象得以緩解。這與譚利平等[10]研究相符。

咖啡因是一種非選擇性的磷酸二酯酶(PDE)抑制劑，其在治療預防BPD中的益處是近幾年才被學界所發現的[11-12]。JING等[13]研究證實咖啡因通過改變三磷酸鳥苷環化水解酶(GCH1)和四氫生物蝶呤(BH4)水平，進而改善內皮一氧化氮合酶(eNOS)活性來保護新生仔鼠未成熟的肺免于高氧誘導的損傷。在家兔建立的高氧肺損傷模型中，也證實了咖啡因可減少肺部功能性和炎性改變[14]。本研究發現，高氧暴露可導致仔鼠肺組織中RAC降低，W/D值與膠原纖維含量增加，而咖啡因干預后可明顯抑制這些現象，這充分說明高氧暴露可增加早產仔鼠肺部炎性反應和肺組織纖維化，使肺發育受阻，咖啡因干預后炎性反應和肺組織纖維化程度減輕。

MAPKs是信號轉導途徑中重要的中間體，包括ERK、c-Jun、P38和ERK5 4種不同級聯反應，ERK作為其重要成員廣泛參與細胞生長、增殖、分化、應激反應和細胞凋亡。高氧刺激可以激活ERK，這種現象通常歸因于細胞活性氧(ROS)生成[15]。LI等[16]利用吉非替尼抑制ERK激酶磷酸化拮抗博萊霉素誘導的肺纖維化，說明ERK信號通路激活可以使肺組織纖維化。因此，能否抑制ERK信號通路的激活成為拮抗高氧誘導肺損傷的關鍵因素。本實驗通過免疫組織化學和Western blot檢測發現，高氧暴露后p-ERK水平明顯升高，咖啡因干預使p-ERK水平降低，說明高氧暴露使ERK信號通路激活，而咖啡因可以抑制這一現象。綜合病理切片、RAC、W/D值和膠原纖維含量結果，本研究認為高氧暴露后，ERK信號通路被激活，導致肺組織出現炎性反應，肺纖維化程度增加；咖啡因干預后，通過降低p-ERK水平，抑制ERK信號通路激活，從而抑制肺組織纖維化來行使在早產仔鼠高氧肺損傷時的保護作用。

本研究雖然明確了咖啡因可通過抑制ERK信號通路的激活以起到在高氧肺損傷中的保護作用，但并未探討咖啡因是通過何種途徑對p-ERK水平產生影響。在今后的工作中，本課題組將著重探討咖啡因影響ERK信號通路行使保護作用的具體機制，為臨床防治BPD提供更多理論依據。