促紅細(xì)胞生成素對大鼠肝缺血再灌注后腸損傷的保護作用及其作用機制研究*

吳鵬俐，石清明，陽德飛，劉富春，陳曉琴，王 靜，肖 莉

(1.成都醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)，成都 610500；2.西部戰(zhàn)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，成都 610021；3.成都醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)，成都 610500；4.解放軍第324醫(yī)院藥劑科，重慶 400020；5.成都醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像學(xué)，成都 610500；6.成都醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，成都 610500)

肝臟移植、肝部分切除等肝臟外科手術(shù)都需要暫時性阻斷肝血流，而重新恢復(fù)血液供應(yīng)后可能造成肝缺血再灌注損傷(HIRI)[1]。這種損傷不僅僅局限于肝臟本身,也涉及小腸。門靜脈回流受阻,可導(dǎo)致腸黏膜屏障功能損害，引起腸內(nèi)毒素及細(xì)菌移位，加重HIRI。基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)是Zn2+依賴的參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解的蛋白水解酶，活化的MMP-9通過降解肝細(xì)胞外基質(zhì)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的趨化遷移[2]。半胱氨酸水解酶-1(caspase-1)是與炎性反應(yīng)密切相關(guān)的蛋白酶，可促進白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-18等細(xì)胞因子成熟，而IL-1β、IL-18在HIRI中起重要作用[3]。促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種含唾液酸的酸性糖蛋白激素，不僅可促進機體生成紅細(xì)胞，還具有抗凋亡、抗氧化、促進血管生成、抑制炎性反應(yīng)等功能。多項研究表明EPO對大鼠HIRI具有保護作用[4],但是否對肝缺血再灌注后小腸上皮細(xì)胞損傷具有保護作用，以及是否通過抑制MMP-9、caspase-1介導(dǎo)炎性反應(yīng)仍未明確。本研究通過構(gòu)建肝缺血再灌注模型，探討EPO對腸損傷的保護作用及其作用機制，為肝臟缺血再灌注后腸損傷的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康成年雄性SD大鼠30只，SPF級，購自四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所[合格證號：SCXK(川)2013-15]，體質(zhì)量180～250 g。

1.1.2主要試劑 EPO購自沈陽三生制藥有限責(zé)任公司；MMP-9抗體、caspase-1抗體、SABC免疫組織化學(xué)試劑盒購自武漢博士得生物工程有限公司；丙二醛測量試劑盒購自南京建成生物工程研究所；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組及模型制備 將實驗動物分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)和EPO低劑量組(L組)、中劑量組(M組)和高劑量組(H組)，每組6只。在制備I/R模型前1 h，L、M、H組分別給予腹腔注射EPO 1 000、3 000、5 000 U/kg，I/R組及Sham組腹腔注射生理鹽水。實驗動物術(shù)前禁食12 h，自由飲水。10%水合氯醛 4 mL/kg腹腔注射麻醉，上腹正中切口，游離肝門血管，無創(chuàng)動脈夾夾閉肝左葉及中葉的門靜脈和肝動脈，1 h后松開動脈夾恢復(fù)阻斷區(qū)血供，建立肝臟缺血再灌注模型。Sham組僅暴露肝門，但不阻斷血管。

1.2.2取材 3 h后取小腸中段組織，生理鹽水沖洗小腸內(nèi)容物，置于4%的多聚甲醛固定12 h。

1.2.3HE染色 常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色。光鏡下觀察及比較各組小腸絨毛和上皮細(xì)胞組織形態(tài)改變。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色和Western blot法測定MMP-9、caspase-1蛋白的表達 采用SABC法進行MMP-9(1∶100)、caspase-1(1∶100)免疫組織化學(xué)染色，以PBS代替一抗做陰性對照。利用 Image-Pro Plus 6.0 測定積分光密度(IOD)值。Western blot法測定各組MMP-9(1∶1 000)、caspase-1(1∶1 000)蛋白表達的變化。

2 結(jié) 果

2.1小腸光鏡下的組織學(xué)改變 HE染色光鏡下顯示，Sham組腸絨毛形態(tài)規(guī)則，排列整齊，隱窩結(jié)構(gòu)完整。I/R組腸絨毛破壞明顯，大量絨毛斷裂脫落，黏膜固有層暴露，上皮細(xì)胞變性壞死，較多炎性細(xì)胞浸潤，隱窩結(jié)構(gòu)破壞。L、M、H組損傷程度較I/R組明顯減輕，小腸絨毛結(jié)構(gòu)基本完整，絨毛頂端可見少量上皮細(xì)胞脫落，伴有部分上皮層和固有層分離，少量炎癥細(xì)胞浸潤。L、M、H組各組比較，M組絨毛基本完整，排列規(guī)則，損傷程度較L和H組明顯減輕，見圖1。

2.2免疫組織化學(xué)MMP-9的表達及IOD值 免疫組織化學(xué)染色顯示，MMP-9主要表達于小腸黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)中，呈棕黃色，部分表達于上皮細(xì)胞膜和基底膜。I/R組MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)量均明顯增多。與I/R組比較，L、M、H組MMP-9的表達減弱。L、M、H組中，M組MMP-9的表達量較其余兩組明顯減少。I/R組大鼠的MMP-9IOD值最高(65.74±6.83),Sham組最低(13.73±2.15)；L組(34.87±3.89)、M組(15.89±1.91)、H組(28.13±4.64)組均明顯低于I/R組(P<0.05);其中M組的MMP-9IOD值最低，與L、H組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3免疫組織化學(xué)caspase-1的表達 免疫組織化學(xué)染色顯示，caspase-1蛋白主要表達于絨毛上皮細(xì)胞，呈棕黃色。此外，黏膜下層，肌層和漿膜也有不同程度的陽性表達。I/R組caspase-1陽性表達明顯增多。L、M、H組caspase-1的表達較I/R組明顯減弱，其中M組caspase-1的陽性細(xì)胞的表達量最低。I/R組大鼠的caspase-1的IOD值最高(65.94±7.20)，Sham組最低(15.13±2.40)；L組(38.40±5.87)、M組(20.59±4.46)、H組(30.30±6.89)均低于I/R組(P<0.05)；其中M組的caspase-1的IOD值最低，與L、H組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

A：I/R組；B：L組；C：M組；D：H組；E：Sham組

圖1 各組小腸上皮的組織學(xué)變化(HE,×100)

A：I/R組；B：L組；C：M組；D：H組；E：Sham組

圖2 MMP-9免疫組織化學(xué)結(jié)果(×100)

2.4Western blot Western blot對應(yīng)的條帶位置出現(xiàn)目的蛋白，MMP-9在92 kD處，caspase-1在45 kD處，GAPDH在36 kD處。MMP-9檢測結(jié)果顯示，與Sham組(0.18±0.06)相比，I/R組MMP-9(1.26±0.18)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；EPO預(yù)處理后，L、M、H組MMP-9的表達均得到了不同程度的抑制(H組：0.42±0.06；M組：0.40±0.07；L組：0.74±0.12)，其中M組對MMP-9的表達抑制作用最明顯，與I/R組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。caspase-1檢測結(jié)果顯示，經(jīng)缺血再灌注損傷后，與Sham組(0.26±0.05)相比，I/R組caspase-1的表達明顯升高(1.13±0.09)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);EPO預(yù)處理后，L、M、H組caspase-1的表達得到了不同程度的抑制(H組：0.51±0.04；M組：0.37±0.03；L組：0.66±0.05)，其中M組對caspase-1表達抑制作用最明顯，與I/R組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

A：I/R組；B：L組；C：M組；D：H組；E：Sham組

圖3 caspase-1免疫組織化學(xué)結(jié)果(×100)

A：Western blot蛋白條帶；B：各組MMP-9、caspase-1灰度值與GAPDH灰度值的比值柱形圖

圖4 各組小腸組織MMP-9、caspase-1的表達

3 討 論

肝臟缺血再灌注不僅造成肝臟損傷，也可引起多器官功能障礙綜合征(MODS)[5]。肝門阻斷后，易造成腸道血流嚴(yán)重淤滯，腸道組織缺血缺氧，導(dǎo)致組織細(xì)胞受損。當(dāng)重新恢復(fù)血流后，血液中大量活性氧自由基造成組織細(xì)胞過氧化及氧化應(yīng)激損傷，使腸黏膜通透性增加，引起細(xì)菌移位及內(nèi)毒素血癥[6-8]。肝恢復(fù)血流時，內(nèi)毒素等毒性物質(zhì)作用于肝臟的枯否細(xì)胞(KC)，產(chǎn)生大量的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1等多種炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)。

MMP-9是一類由中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的具有降解ECM效應(yīng)Zn2+依賴的蛋白酶，基本存在于機體所有臟器中。在正常機體狀態(tài)下，MMP-9主要是作用于細(xì)胞外基質(zhì)，維持基質(zhì)的動態(tài)平衡，當(dāng)出現(xiàn)不同因素導(dǎo)致的機體損傷時，MMP-9水平升高，進而導(dǎo)致器官、組織的損傷及破壞。研究表明，MMP-9介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的浸潤在HIRI過程中起著關(guān)鍵作用。缺血再灌注后中性粒細(xì)胞激活內(nèi)皮細(xì)胞，上調(diào)并活化MMP-9，參與肝缺血再灌注損傷[9-11]。此外，PALLADINI等[12]已經(jīng)證實發(fā)生肝臟缺血再灌注損傷后，不僅肝臟組織本身MMP-9水平升高，同時在肺、腎臟等其他器官中MMP-9水平也升高。HANIFEH等[13]研究表明MMP-9可調(diào)控腸黏膜組織細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解及合成代謝。代謝失衡會使腸黏膜屏障破壞，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤，ECM成分降解，MMP-9水平與腸黏膜屏障損傷密切相關(guān)。caspase-l可表達于Kupffer細(xì)胞，經(jīng)炎性體活化的caspase-1能夠切割I(lǐng)L-1β前體，形成具有活性的IL-1β和IL-18，產(chǎn)生成熟的IL-lβ、IL-18，從而誘導(dǎo)級聯(lián)炎性反應(yīng)介導(dǎo)缺血再灌注損傷[14-15]。

EPO是一種由腎臟產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)效應(yīng)的糖蛋白，具有抗炎、抗凋亡、抗腫瘤等廣泛的生物學(xué)活性。EPO不僅僅能促進紅細(xì)胞的成熟，它對心、腦、腎等多種器官缺血再灌注也有一定的保護作用[16-18]。本研究通過建立大鼠肝缺血再灌注模型，探討EPO對肝缺血再灌注引起腸損傷的保護作用。研究結(jié)果顯示，EPO預(yù)處理可明顯減輕肝缺血再灌注引起的小腸黏膜損傷和炎性反應(yīng)，如小腸絨毛斷裂脫落，上皮細(xì)胞變性壞死，炎性細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管出血、壞死、潰瘍等損傷程度較I/R組明顯降低。EPO預(yù)處理各組比較，M組絨毛基本完整，排列規(guī)則，損傷程度較L和H組明顯減輕。本研究檢測了各組大鼠的小腸組織MMP-9及caspase-1的表達，免疫組織化學(xué)及Western blot結(jié)果顯示I/R組小腸黏膜上皮細(xì)胞MMP-9水平明顯增高，EPO預(yù)處理MMP-9水平明顯下降，這表明EPO可能通過下調(diào)MMP-9水平，減少中性粒細(xì)胞的遷移浸潤，同時抑制腸黏膜組織細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而減輕腸黏膜屏障損傷。缺血再灌注后，caspase-1的表達也明顯升高，EPO預(yù)處理可以明顯抑制caspase-1的表達，這說明EPO可抑制caspase-1的活化，以及下游炎性因子IL-1β和IL-18的表達。

綜上所述，EPO對于肝缺血再灌注后的腸損傷具有保護作用。EPO的這種保護機制可能與EPO能抑制caspase-1活化，下調(diào)下游的炎性因子，從而降低MMP-9水平，抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。3 000 U/kg的EPO預(yù)處理的治療效果最佳。