子宮內膜異位癥患者子宮內膜組織中ID2、PRELP、SMOC2基因表達和臨床意義*

馬 莉，劉春喜，姚 麗

鄭州人民醫院 婦科(鄭州 450000)

子宮內膜異位癥是婦科常見的一種具有功能的子宮內膜組織出現并生長于正常位置以外部位的良性婦科疾病，但異位宮內膜常發生病變，并累及盆腔、子宮肌層及卵巢等部位，進而導致盆腔黏連、痛經、慢性盆腔痛及不孕等癥狀[1]。子宮內膜異位癥的發病機制尚未完全清楚。研究[2]表明，子宮內膜異位癥的子宮內膜組織發生增殖并形成植入性病灶，且發病過程涉及黏附、侵襲及血管生成，病理過程與腫瘤組織的增殖及遷移等相似。目前，認為細胞生物學相關因子與子宮內膜異位癥的發生發展有關。研究[3]表明，DNA結合抑制因子2(inhibitor of differentiation/DNA binding 2，ID2)與腫瘤細胞的增殖及遷移有關。富含脯氨酸/精氨酸的末端富含亮氨酸的重復蛋白(proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein，PRELP)可促進胰腺癌細胞的增殖及遷移并參與其病變過程[4]。SPARC相關模塊化鈣結合蛋白2(SMOC2)主要在胚胎發育過程中高表達且可影響生長因子、信號轉導、血管生成及細胞增殖等多種細胞功能[5]。目前，關于ID2、PRELP及SMOC2在子宮內膜異位癥患者子宮內膜組織中的表達研究相對較少，因此，本研究探討ID2、PRELP及SMOC2在患者子宮內膜組織中的異常表達及其臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年3月至2018年1月于鄭州人民醫院婦科診治的子宮內膜異位癥患者102例為試驗組，所有患者均經病理證實診斷為子宮內膜異位癥患者。另以同期本院收治的98例子宮肌瘤患者為對照組，所有患者均接受子宮肌瘤切除術。試驗組患者年齡32～67(45.64±5.23)歲，對照組年齡33～66(46.34±5.27)歲。本研究經我院倫理委員會批準，參與試驗人員均知情同意。納入標準：1)符合子宮內膜異位癥的診斷標準[6]；2)未接受過激素治療者；3)無其他嚴重性激素類疾病。排除標準：1)患有子宮內膜腫瘤、子宮肌瘤等疾病者；2)嚴重肝腎功能障礙者；3)排除嚴重的內分泌、呼吸、消化等系統疾病；4)臨床資料不全者。兩組患者年齡比較，差異無統計學意義(t=0.943，P=0.347)，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 qRT-PCR法檢測兩組子宮內膜組織中ID2、PRELP、SMOC2 mRNA表達量 術中分別切取子宮內膜組織并留取兩份，第1份標本用PBS緩沖液清洗后，儲存于液氮罐中，并采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測ID2、PRELP、SMOC2 mRNA相對表達量。按照Trizol試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取總RNA。參照反轉錄試劑盒(美國ThermoFisher公司)合成cDNA。采用qRT-PCR試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)進行反應，反應體系為20 μL：2×SYBR Mix 10 μL，cDNA 1 μL；ddH2O 8 μL；上下游引物各0.5 μL，均以β-actin為內參引物，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物設計如下(表1)。反應設置程序為：95 ℃ 預變性1 min；95 ℃ 15 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 2 min，共40個循環。采用2-△△CT法對子宮內膜組織中ID2、PRELP、SMOC2 mRNA表達水平進行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2 Western blot法檢測子宮內膜組織中ID2、PRELP、SMOC2蛋白表達情況 將1.2.1中留取的第2份子宮內膜組織樣本進行研磨，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解緩沖液中，提取各組子宮內膜組織總蛋白并測定蛋白總量。采用Western blot法，以β-actin蛋白作為內參，檢測子宮內膜組織中ID2、PRELP、SMOC2蛋白水平，嚴格按照操作說明進行檢測，采用Tanon軟件拍攝圖像，并對蛋白表達水平進行半定量分析。

1.3 檢測及觀察指標

分別取兩組受試人員清晨空腹靜脈血5 mL并立即分為兩份，其中1份簡單離心后，吸取上清，并采用酶聯免疫吸附法，按照檢測試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)說明書，測定血清中血管內皮生長因子(VEGF)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。另1份樣品置于抗凝管內，并加入白介素-1β(IL-1β)及癌抗原125(CA125)檢測試劑(上海普奧生物醫藥有限公司)，利用膠體金法檢測其表達水平。觀察兩組VEGF、TNF-α、IL-1β及CA125水平，并分析子宮內膜異位癥患者子宮內膜組織中ID2、PRELP、SMOC2表達與VEGF、TNF-α、IL-1β及CA125水平的相關性。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 兩組臨床指標比較

試驗組VEGF、TNF-α、IL-1β及CA125含量均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(表2)。

表2 兩組臨床指標比較

2.2 兩組子宮內膜組織中ID2、PRELP、SMOC2 mRNA及蛋白表達檢測比較

與對照組相比，試驗組子宮內膜組織中ID2、PRELP、SMOC2 mRNA表達量均明顯升高(P<0.05)；Western blot檢測結果顯示，試驗組ID2、PRELP、SMOC2蛋白表達水平均高于對照組(P<0.05)(表3～4、圖1)。

組別nID2/β-actinPRELP/β-actinSMOC2/β-actin對照組981.07±0.031.02±0.021.08±0.02試驗組1022.43±0.322.74±0.542.04±0.52t41.89231.50818.261P<0.001<0.001<0.001

組別nID2/β-actinPRELP/β-actinSMOC2/β-actin對照組9849.76±7.6838.42±3.3442.27±3.79試驗組10285.16±6.1788.97±15.6889.57±16.47t36.00531.23827.731P<0.001<0.001<0.001

圖1 Western blot法檢測兩組子宮內膜組織中各蛋白表達水平

2.3 試驗組子宮內膜組織中ID2、PRELP、SMOC2與患者臨床指標的關系

試驗組患者子宮內膜組織中ID2與VEGF、IL-1β及CA125呈正相關，PRELP與VEGF、TNF-α及CA125呈正相關，SMOC2與IL-1β及CA125呈正相關，差異有統計學意義(P<0.05)(表5)。

表5 試驗組子宮內膜組織中ID2、PRELP、SMOC2與患者臨床指標的關系

2.4 ROC曲線分析ID2、PRELP、SMOC2對子宮內膜異位癥的預判價值

ROC曲線分析顯示，子宮內膜組織中ID2、PRELP、SMOC2對臨床診斷子宮內膜異位癥具有較高的預判價值，結果顯示，ID2的AUC面積為0.796，敏感性為86.34，特異性為64.10，截斷值為1.66；PRELP的AUC面積為0.919，敏感性為92.41，特異性為82.05，截斷值為2.10；SMOC2的AUC面積為0.818，敏感性為92.06，特異性為58.97，截斷值為1.83(圖2、表6)。

圖2 ID2、PRELP、SMOC2的ROC分析圖

2.5 相關因素影響子宮內膜異位的Logistic回歸分析

Logistic多元回歸分析結果顯示，子宮內膜組織中ID2、PRELP及SMOC2均為子宮內膜異位癥患者的危險因素(表7)。

表7 相關因素影響子宮內膜異位的Logistic回歸分析

3 討論

子宮內膜異位癥可使盆腔炎內環境發生慢性炎癥改變，從而影響卵子存活，并導致患者不孕，其發生發展可以導致患者多種不良臨床結局的發生[7]。目前，臨床采用腹腔鏡手術去除肉眼可見的病變，但仍有部分患者不能懷孕。治療后疾病的病情進展率較高，可能是其存在分子水平異常從而影響受孕及胚胎發育。研究[8]表明，細胞生物學相關因子改變與子宮內膜異位癥發病機制相關，可通過影響異位癥子宮內膜組織中的腺體細胞發生增殖及侵襲等生理過程，進而加快腺體細胞的浸潤過程，最終導致病情持續性惡化。因而，尋求特異性分子標志物對子宮內膜異位癥的診斷及治療均具有重要意義。研究[9]表明，ID2、PRELP及SMOC2與卵巢子宮內膜瘤病變發生有關，且均可直接或間接參與細胞遷移、侵襲及血管生成等過程。關于子宮內膜異位癥患者中ID2、PRELP及SMOC2表達研究相對較少，因此本研究主要探討ID2、PRELP及SMOC2在子宮內膜異位癥患者的子宮內膜組織中表達水平，可為子宮內膜異位癥患者的發病機制提供理論依據。

ID2是分化/DNA結合抑制因子家族的成員，其主要通過與堿性螺旋-環-螺旋類轉錄因子結合，形成異源二聚體而導致ID2缺失，影響其與靶基因的結合，進而抑制相關基因表達[10]。研究[11]表明，ID2異常表達可促進癌癥細胞增殖及遷移，其與細胞黏附、蛋白質糖基化、細胞侵襲及血管生成緊密相關。由于子宮內膜異位癥與癌癥之間的相似性，本研究通過qRT-PCR法檢測試驗組及正常組子宮內膜組織中ID2 mRNA表達量，并采用Western blot法檢測其蛋白表達水平，結果顯示，試驗組患者ID2 mRNA表達量及蛋白表達水平均高于對照組，說明子宮內膜異位癥子宮內膜組織中ID2呈上調表達。觀察試驗組子宮內膜組織中ID2與患者臨床指標的關系，結果顯示，試驗組患者子宮內膜組織中ID2與VEGF、IL-1β及CA125呈正相關，其中VEGF高表達可增加異位癥腺體細胞的浸潤能力[12]，IL-1β與CA125在子宮內膜異位癥患者中高表達，并可通過損傷異位癥病灶組織中的線粒體而提高腺體細胞的黏附能力，最終嚴重損傷基底膜層上皮組織[13-14]。說明ID2高表達與子宮內膜異位癥患者病情進展緊密相關，推測子宮內膜組織中ID2表達可作為預測子宮內膜異位癥患者嚴重程度的指標。

PRELP在胰腺癌組織中高表達，其可與基底膜蛋白聚糖及膠原蛋白結合，進而抑制相關基因表達，并促進腫瘤細胞的遷移及侵襲[15]。相關研究[16]表明，PRELP與新血管形成有關，并可在軟骨及胚胎發育過程中高度表達。本研究通過qRT-PCR與Western blot法檢測PRELP表達，結果顯示，試驗組子宮內膜組織中PRELP mRNA及蛋白表達均高于對照組，說明子宮內膜異位癥患者子宮內膜組織中PRELP呈上調表達。同時，本研究發現，PRELP與VEGF、TNF-α及CA125呈正相關，其中TNF-α在腦組織及胎盤發育過程中發揮重要作用，并與腺體細胞的浸潤能力緊密相關，可在發生病變時高度表達并促進細胞的增殖及遷移。說明PRELP可能參與子宮內膜異位癥發生發展過程，推測PRELP可能通過影響TNF-α等的表達進而促進患者病情發展。

SMOC2主要存在于非基底膜中，并與心臟、腎等組織器官發育有關。研究[17]表明，SMOC2還在胸腺、卵巢中表達，并參與許多相關生理過程。近來研究[18]發現，SMOC2的生物學功能可通過刺激人類內皮細胞發生有絲分裂，增強亞基成纖維細胞生長因子及血管內皮生長因子的血管生成。基于此，本研究通過qRT-PCR與Western blot法檢測子宮內膜異位癥患者及正常子宮內膜組織中SMOC2表達，結果顯示，試驗組患者子宮內膜組織中SMOC2表達高于對照組，說明SMOC2在子宮內膜異位癥患者子宮內膜組織中呈高度表達。進一步研究發現，SMOC2與IL-1β及CA125呈正相關，說明SMOC2可能通過與血清相關因子相互作用進而參與子宮內膜異位癥的發生發展并加快病情惡化。本研究ROC曲線分析結果顯示，子宮內膜組織中ID2、PRELP、SMOC2對臨床診斷子宮內膜異位癥具有較高的預判價值，說明子宮內膜組織中ID2、PRELP、SMOC2可作為臨床診斷子宮內膜異位癥的預測因子。同時，本研究對影響子宮內膜異位的相關因素進行Logistic回歸分析，結果顯示，子宮內膜組織中ID2、PRELP及SMOC2均為子宮內膜異位癥患者的危險因素，說明三者均可相互作用并對疾病的發展起到促進作用。本研究結果揭示，子宮內膜組織中ID2、PRELP、SMOC2高表達并可促進新生血管的生成，進而增加病變細胞的增殖速率，導致子宮內膜異位癥病情持續性發展，且三者均可作為臨床診斷子宮內膜異位癥的分子標記物。

綜上所述，子宮內膜組織中ID2、PRELP、SMOC2高表達與子宮內膜異位癥的發生發展緊密相關，三者均可能成為子宮內膜異位癥的候選特異性靶基因，且均可作為臨床診斷子宮內膜異位癥的標志物。本研究存在不足之處，關于ID2、PRELP、SMOC2在子宮內膜異位癥發病及進展中的確切機制還有待進一步研究。