MiR-92a通過靶向抑制PTEN的表達促進血管平滑肌細胞的增殖以及遷移

趙曦雯, 張玉梅

海南省第三人民醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)科 (三亞 572000)

血管平滑肌細胞的異常增殖與多種心血管 (例如動脈粥樣硬化、肺動脈高壓以及原發(fā)性高血壓等)的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[1]。因此，研究血管平滑肌細胞的異常增殖分子機制能夠為我們尋找新的治療心血管疾病靶點提供思路。血管平滑肌細胞的增殖有多種調(diào)節(jié)因子的參與， 最近微小RNA(microRNA, miRNA)在血管平滑肌細胞中的增殖作用受到越來越多的關(guān)注。MiRNAs屬于一類單鏈非編碼短RNA (約21 nt)，其能夠參與mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[2]。MiRNA能夠與靶向基因的3'非翻譯區(qū)域(3'untranslated region, 3'UTR)結(jié)合從而促進mRNA的降級以及抑制蛋白翻譯，最終對基因的表達水平起到調(diào)節(jié)作用[2]。已有研究[3-6]發(fā)現(xiàn)miRNA能夠通過調(diào)控不同的生物過程參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，其中就包括心血管疾病。一些miRNA如miR-21、miR-25、 miR-221、miR-143等在血管損傷以及動脈粥樣硬化中調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞增殖中起重要作用。研究[7]也有發(fā)現(xiàn)miR-29a在多種癌組織中表達上調(diào)，并且miR-29a對這些癌細胞的增殖起到促進作用，但是其對血管平滑肌細胞增殖作用尚未有報道。本研究擬探索miR-29a對血管平滑肌增殖的影響，并探討其中的分子機制，從而為治療心血管疾病提供新的試驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人主動脈血管平滑肌細胞(簡稱血管平滑肌細胞)購于美國ATCC公司；Smooth Muscle Cell Growth Medium培養(yǎng)液、胎牛血清以及血小板衍生生章因子-bb(Platelet-derived growth factor-bb, PDGF-bb)購于美國Sigma公司；CCK-8試劑盒購于北京碧云天生物科技有限公司；相關(guān)的PCR引物購于上海吉瑪生物科技有限公司；miR-92a 模擬物(miR-92a mimic)、模擬物對照(mimic control)、miR-92a抑制劑(miR-92a inhibitor)以及抑制劑對照(inhibitor control)、Phosphatase and tensin homolog (PTEN) siRNA (si-PTEN)以及對照siRNA (si-NC)均購于廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen公司；螢光素酶pGL3載體購于美國Promega公司；western blot 相關(guān)抗體均購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

血管平滑肌細胞利用含有10% 胎牛血清的Smooth Muscle Cell Growth Medium培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞于含有5% CO2加濕培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。

1.3 PDGF-bb處理細胞、miRNA以及小分子干擾RNA (siRNA)的轉(zhuǎn)染

利用PDGF-bb (20 ng/mL)以及陰性對照(正常培養(yǎng)基)處理血管平滑肌細胞48 h后，進行后續(xù)相關(guān)試驗，每組試驗重復(fù)3次。miR-92a mimic和其陰性對照mimic control, miR-92a inhibitor和其陰性對照inhibitor control, PTEN siRNA (si-PTEN)以及其陰性對照序列打亂的siRNA (si-NC)利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染，于轉(zhuǎn)染48 h后，將細胞處理進行相關(guān)試驗，每組試驗重復(fù)3次。

1.4 實時定量PCR (qRT-PCR)

根據(jù)試劑生產(chǎn)商的說明用TRIzol試劑對處理后的血管平滑肌細胞進行RNA提取。利用ABI 7500HT實時定量PCR系統(tǒng)進行qRT-PCR試驗。用TaqMan miRNA測定試劑盒測量miR-92a的表達水平；利用SYBR-Green PCR Master Mix試劑盒按照制造商的說明檢測PTEN mRNA 表達水平。U6作為miR-92a表達水平的內(nèi)參，GAPDH 作為PTEN mRNA表達水平的內(nèi)參。采用2-ΔΔCt公式對檢測的基因表達進行計算。每組試驗重復(fù)3次。

1.5 CCK-8試驗

利用CCK-8試驗檢測細胞的增殖能力，將處理后的血管平滑肌細胞于96孔平板中培養(yǎng)48 h。棄上清液，加入CCK-8溶液，每孔加入37 ℃孵育2 h，然后通過酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的光密度值。每組試驗重復(fù)3次。

1.6 Transwell遷移試驗

利用Transwell遷移試驗檢測血管平滑肌細胞的增殖能力，將處理后的血管平滑肌細胞用無血清Smooth Muscle Cell Growth Medium培養(yǎng)基重懸吸取100 μL懸液加到Transwell小室的上層，下層加入500 μL含有10%胎牛血清的Smooth Muscle Cell Growth Medium培養(yǎng)液，5% CO2，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將Transwell小室取出，利用PBS洗滌3次后再利用4%的多聚甲醛固定20 min, 然后利用結(jié)晶紫染色30 min，在顯微鏡下計數(shù)。每組試驗重復(fù)3次。

1.7 Western blot試驗

用RIPA裂解緩沖液從處理后的血管平滑肌細胞中提取蛋白質(zhì)。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)。 電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上；在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h后，然后將膜與兔多克隆抗體PTEN以及小鼠單克隆β-actin在4 ℃過夜孵育。然后將膜在室溫下與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗孵育2 h，用化學(xué)發(fā)光試劑顯色并且拍照。每組試驗重復(fù)3次。

1.8 雙螢光素酶報告實驗

為了構(gòu)建熒光素酶報道基因載體，將含有miR-92a結(jié)合位點的PTEN 3'UTR的野生型(wild type, WT)或突變的(mutant, MUT)片段克隆到pGL3報告螢火素酶載體中載體，分別命名為pGL3-PTEN 3'UTR(WT)和pGL3-PTEN 3'UTR (MUT)。將細胞以每孔1×104個細胞接種在96孔板中。當(dāng)細胞達到60%匯合時，將細胞利用Lipofectamine 2000試劑與miR-92a(或者mimic control)以及pGL3-PTEN 3'UTR (WT)[或者pGL3-PTEN 3'UTR(MUT)]共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，用雙螢光素酶報告分析系統(tǒng)測量螢光素酶活性。每組試驗重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PDGF-bb促進血管平滑肌細胞增殖以及miR-92a表達

本實驗首先觀察了PDGF-bb (20 ng/mL)處理血管平滑肌細胞48 h后對細胞增殖的影響。CCK-8試驗結(jié)果顯示PDGF-bb處理48 h后可以促進血管平滑肌細胞的增殖，與對照組相比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)(圖1A)。同時我們利用qRT-PCR觀察了PDGF-bb處理血管平滑肌細胞后對miR-92a表達水平的影響，結(jié)果顯示PDGF-bb可以增加miR-92a的表達水平，與對照組相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)(圖1B)。

圖1PDGF-bb促進血管平滑肌細胞增殖以及miR-92a表達

注：A：CCK-8 試驗檢測PDGF-bb (20 ng/mL)對血管平滑肌細胞的增殖影響，與對照組相比較，*P<0.05；B： qRT-PCR 檢測PDGF-bb對血管平滑肌細胞中miR-92a表達水平的影響，與對照組相比較，**P<0.01

2.2 PTEN是miR-92a的一個下游靶點

通過生物信息學(xué)www.targetscan.org網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)PTEN是miR-92a的一個下游靶點。miR-92a與PTEN 3'UTR區(qū)域有7個堿基對互補結(jié)合區(qū)域(圖2A)。螢火素酶試驗結(jié)果顯示miR-92a過表達抑制pGL3-PTEN 3'UTR (WT)螢光素酶的活性，與mimic control組相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖2B)；而miR-29a過表達對pGL3-PTEN 3'UTR (MUT)螢光素酶活性沒有影響 (P>0.05)(圖2C)。進一步的qRT-PCR試驗發(fā)現(xiàn)miR-92a mimic 轉(zhuǎn)染可以明顯的抑制血管平滑肌細胞PTEN mRNA的表達水平，與mimic control相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖2D)；同時western blot 結(jié)果顯示miR-92a過表達可以抑制PTEN蛋白表達水平(圖2E)。

圖2 FOPX1是miR-92a的一個下游靶點

注：A： 生物信息學(xué)預(yù)測的miR-92a與PTEN 3'UTR 結(jié)合的序列；B：western blot 檢測miR-92a過表達對PTEN蛋白水平的影響；C： miR-92a過表達對pGL3-PTEN 3'UTR (WT)螢光素酶活性的影響，與mimic control組相比較，**P<0.01；D：miR-92a過表達對pGL3-PTEN 3'UTR(MUT)螢光素酶活性的影響；E：qRT-PCR檢測miR-92a過表達對PTEN mRNA的表達水平的影響，與mimic control組相比較，**P<0.01

2.3 MiR-92a促進血管平滑肌細胞的增殖以及遷移

為了進一步研究miR-92a對血管平滑肌細胞增殖以及遷移的影響，我們將細胞轉(zhuǎn)染不同的miRNA來促進或者抑制miR-92a在血管平滑肌細胞中的表達。miR-92 mimic 轉(zhuǎn)染可以增加血管平滑肌細胞miR-92a的表達水平，與mimic control相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001)；而miR-92a inhibitor 轉(zhuǎn)染可以抑制血管平滑肌細胞的miR-92a的表達水平，與inhibitor control組相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3A)。CCK-8試驗結(jié)果顯示，miR-92a過表達可以促進血管平滑肌細胞的增殖 (P<0.01)，相反，miR-92a低表達能夠明顯的抑制血管平滑肌細胞的增殖 (P<0.01)( 圖3B)。進一步的Transwell遷移試驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-92a mimic可以促進血管平滑肌細胞的遷移，與mimic control組相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；而miR-92a inhibitor轉(zhuǎn)染可以抑制血管平滑肌細胞的遷移，與inhibitor control組相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖3C)。

圖3 MiR-92a促進血管平滑肌細胞的增殖以及遷移

注：A: qRT-PCR 檢測血管平滑肌細胞轉(zhuǎn)染不同miRNA(mimic control、miR-92a mimic、inhibitor control以及miR-92a inhibitor) 后對miR-29a表達水平的影響，與mimic control組相比較，***P<0.001，與inhibitor control組相比較，&P<0.05；B: CCK-8試驗檢測血管平滑肌細胞轉(zhuǎn)染不同miRNA后對細胞增殖的影響；與mimic control組相比較，**P<0.01；與inhibitor control組相比較，&&P<0.01；C: Tranwell 遷移試驗檢測血管平滑肌細胞轉(zhuǎn)染不同miRNA后對細胞遷移的影響，與mimic control組相比較，***P<0.001，與inhibitor control組相比較，&&P<0.01

2.4 PTEN低表達促進血管平滑肌細胞的增殖以及遷移

為了進一步闡述PTEN對血管平滑肌細胞增殖以及遷移的影響，我們將細胞分別轉(zhuǎn)染了si-NC或者si-PTEN。qRT-PCR 結(jié)果顯示si-PTEN的轉(zhuǎn)染可以抑制PTEN mRNA的表達水平，與對照組相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖4A), western blot 結(jié)果也顯示si-PTEN的轉(zhuǎn)染可以降低血管上皮細胞的PTEN蛋白水平(圖4B)。通過CCK-8試驗我們發(fā)現(xiàn)PTEN低表達可以促進血管平滑肌細胞的增殖 (P<0.01)(圖4C)，進一步的Transwell 遷移試驗結(jié)果顯示PTEN低表達同時可以促進血管平滑肌細胞的遷移 (P<0.01)(圖4D)。

圖4 PTEN低表達促進血管平滑肌細胞的增殖以及遷移

注：A：qRT-PCR檢測血管平滑肌細胞轉(zhuǎn)染si-NC或者si-PTEN后PTEN mRNA的表達水平，與si-NC組相比較，***P<0.001； B： western blot 檢測血管平滑肌細胞轉(zhuǎn)染si-NC或者si-PTEN后PTEN蛋白水平；C：CCK-8試驗檢測血管平滑肌細胞轉(zhuǎn)染si-NC或者si-PTEN 后的細胞增殖，與si-NC組相比較，**P<0.01；D：Tranwell 遷移試驗檢測血管平滑肌細胞轉(zhuǎn)染si-NC或者si-PTEN后對細胞遷移的影響，與si-NC組相比較，**P<0.01

3 討論

研究[2]表明miRNA參與心血管疾病中血管平滑肌細胞的增殖和血管重塑的調(diào)節(jié)。體外實驗[5, 8-11]表明miR-21、miR-221/222、miR-24、miR-26a和miR-146a能夠直接誘導(dǎo)血管平滑肌增殖并介導(dǎo)PDGF-bb引起的血管平滑肌細胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)PDGF-bb能夠促進血管平滑肌細胞的增殖，同時能夠增加miR-92a的表達水平。進一步的體外試驗發(fā)現(xiàn)miR-92a過表達可以促進血管平滑肌細胞的增殖，而miR-92a低表達抑制血管平滑肌細胞的增殖以及遷移。進一步的機理研究發(fā)現(xiàn)miR-92a可以通過作用于PTEN 3'UTR 來抑制PTEN的表達水平。而抑制PTEN的表達可以促進血管平滑肌細胞的增殖以及遷移。

miRNA參與血管平滑肌細胞的多種生物過程。Yue等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-147b能夠通過靶向YY1基因以及調(diào)節(jié)Wnt/beta-catenin信號通路來影響血管平滑肌細胞的增殖以及遷移；Badi等[13]發(fā)現(xiàn)miR-34a可以通過抑制SIRT1以及AxL基因的表達從而促進血管平滑肌細胞的鈣化 ；Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-4463通過調(diào)控AMOT基因的表達來抑制血管平滑肌細胞的遷移 。miR-92a可以在不同種類的癌細胞中起到促進細胞增殖以及遷移的作用。Lu等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-92a能夠促進肺癌細胞的增殖以及遷移，并且能夠促進肺癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程 。 Xiao 等[16]研究發(fā)現(xiàn)miR-92a通過調(diào)控PTEN/AKT信號通路來促進骨肉瘤細胞的增殖。研究[17]也有發(fā)現(xiàn)miR-92a通過調(diào)控MKK-4/JNK信號通路來抑制血管平滑肌細胞的凋亡 。本研究進一步發(fā)現(xiàn)PDGF-bb促進miR-92a的表達，同時miR-92a過表達可以促進血管平滑肌細胞的增殖以及遷移。綜上，這些結(jié)果提示miR-92a對血管平滑肌細胞的增殖以及遷移起到促進作用。

通過進一步生物信息學(xué)預(yù)測以及雙螢光素酶試驗結(jié)果顯示PTEN是miR-92a的一個下游靶向基因。PTEN是雙重磷酸酶抑制劑，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，心臟、肝臟、腎臟、胃、腸、肺和皮膚中表達為組成型分泌蛋白。 目前已知PTEN參與多種生理和病理過程的調(diào)節(jié)，特別是癌細胞的增殖、分化、凋亡、粘附和遷移。PTEN的異常作用與心肌細胞肥大有關(guān)[18-19]。 血管發(fā)育期間和體內(nèi)血管損傷后平滑肌細胞的高生長速率與PTEN失活有關(guān)[20]。 增加PTEN的活性和表達可抑制血管平滑肌細胞的增殖[21]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)miR-29a過表達可以抑制PTEN在血管平滑肌細胞中的表達水平，同時利用siRNA沉默PTEN的表達可以促進血管平滑肌細胞的增殖以及遷移，這些結(jié)果提示miR-92a可能通過靶向抑制PTEN的表達從而來促進血管平滑肌細胞的增殖以及遷移。

綜上所述，本研究通過體外試驗發(fā)現(xiàn)miR-92a在過度增殖的血管平滑肌細胞中表達上調(diào)，進一步的機理研究結(jié)果提示miR-92a通過靶向抑制PTEN的表達從而來促進血管平滑肌細胞的增殖以及遷移。