阿托伐醌通過ROS介導的自噬抑制結直腸癌細胞增殖的研究

蘭景彬，楊 鈴，潘克儉

1.成都醫學院 基礎醫學院(成都610500)；2.成都醫學院 生物科學與技術學院(成都610500)

結直腸癌是常見高發的惡性消化道腫瘤之一，盡管結直腸癌的診斷和治療都已取得了一些進展，但其發病和病死率仍逐年上升，是全球癌癥致死的主要原因之一[1]。迄今為止，結直腸癌的主要治療方法是手術切除與放化療結合，但由于結直腸癌的易復發和遠端轉移，常導致治療失敗，因此尋找高效的抗癌藥物成為迫切需解決的臨床問題[2]。目前，傳統的抗癌藥物選擇性低、毒性大，而新藥開發成本高、周期長且成功率低，所以近年來“舊藥新用”給結直腸癌治療提供了新的思路。阿托伐醌是一種萘醌類化合物，具有廣譜的抗原蟲活性，長期以來主要用于治療卡氏肺囊蟲肺炎和瘧疾等疾病[3-4]。目前，研究發現阿托伐醌在甲狀腺癌[5]、前列腺癌[6]等惡性腫瘤中具有很好的抗腫瘤效應，但其在結直腸癌的治療研究中尚未見報道。此外，細胞自噬屬于Ⅱ型程序性細胞死亡，其相關機制研究已成為腫瘤治療的一個研究新熱點。因此，本研究擬采用人結直腸癌SW480細胞和HCT116細胞為研究對象，探究阿托伐醌對結直腸癌細胞的抑制作用及作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人結直腸癌細胞SW480、HCT116(購自中科院上海細胞所)；噻唑藍(MTT)和3-甲基腺嘌呤(3-MA)(購自美國Sigma公司)；阿托伐醌(質量分數≥98%)、乙酰半胱氨酸(NAC)和羥基氯喹(CQ)[購自阿拉丁試劑(上海)有限公司]；活性氧(ROS)檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)；胎牛血清、細胞培養基Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(購自以色列BI公司)；蛋白質預染Marker(購自美國ThermoFisher公司)；Atg5siRNA(購自上海吉瑪制藥技術有限公司)；Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3、β-actin、LC3、p62、Beclin-1單克隆抗體(購自Cell Signaling Technology公司)；鼠二抗、兔二抗均購自成都正能生物技術有限責任公司；PVDF膜、ECL顯影液(購自美國Millipore公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SW480、HCT116細胞采用DMEM培養基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)于37 ℃，5%CO2下培養，隔天換液，用于實驗的細胞均處于對數生長期。

1.2.2 細胞活力 實驗將SW480、HCT116細胞分別接種于96孔板(密度為3×103個/孔)，于37 ℃，5%CO2培養箱中培養過夜。待細胞貼壁后，對照組給予DMEM培養基，實驗組加入含不同濃度(0.12、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L)阿托伐醌的DMEM培養基，放入37 ℃培養箱中繼續培養24 h，每組設置5個復孔，另設置不含細胞僅有培養基的空白對照孔。藥物處理完畢后，避光下每孔加入5 mg/mL的MTT試劑20 μL，繼續37 ℃培養4 h，而后棄去液體，每孔加入150 μL的DMSO振蕩溶解，以空白對照孔調零，用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度(A)值，檢測細胞活力。

1.2.3 細胞克隆 形成實驗取對數期生長的結直腸癌細胞接種于無菌6孔板中，接種密度為100個細胞/孔，鋪勻后于37 ℃，5%CO2培養箱中培養過夜。待細胞貼壁后，加入2 mL含不同濃度(0、4、8 μmol/L)阿托伐醌的培養基進行培養，每2～3 d更換一次培養基，2周后終止培養，棄六孔板中培養液，用PBS小心清洗3次，加入1 mL的4%多聚甲醛固定細胞15 min，然后棄去多聚甲醛，并用PBS清洗3次，加入1 mL的結晶紫染液，室溫染色20 min，PBS清洗結晶紫，觀察細胞克隆情況并拍照。

1.2.4 免疫熒光檢測 自噬體的形成參照文獻[7]方法，在6孔板中放入多聚賴氨酸處理過的蓋玻片，然后將結直腸癌細胞以合適的密度接種到蓋玻片上，于37 ℃，5%CO2培養箱中培養過夜。待細胞貼壁后，加入不同濃度的阿托伐醌，繼續培養24 h，用4%多聚甲醛固定細胞15 min，0.5%TritonX-100室溫通透20 min，PBS清洗3次，5 min/次。然后用含3%牛血清白蛋白的PBS封閉30 min，4 ℃下用LC3一抗孵育過夜，隨后用FITC-熒光二抗室溫孵育1 h，熒光顯微鏡下過LC3抗體免疫熒光強弱檢測細胞自噬體的形成。

1.2.5 活性氧(ROS)的檢測 采用流式細胞儀檢測經熒光探針DCFH-DA標記的用阿托伐醌處理后的細胞內活性氧(ROS)的表達情況。參考試劑盒方法，將用阿托伐醌處理好后的結直腸癌細胞用以雙無培養基稀釋成終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA溶液進行懸浮，于37 ℃，5%CO2培養箱中培養1 h，每5 min顛倒混勻1次，使得細胞與探針能充分接觸，然后將處理過的細胞清洗并重新懸浮在PBS中，用流式細胞儀測量DCF熒光強弱。

1.2.6 免疫印跡檢測 蛋白表達收集藥物處理后的細胞，按1×106個細胞/mL的密度加入含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液100 μL，渦旋振蕩混勻，于冰上裂解30 min， 4 ℃下以轉速13 000 r/min，離心半徑7 cm，離心15 min，取上清液進行蛋白定量，加入5×上樣緩沖液制成電泳樣品，于沸水浴中加熱10 min。將制好的蛋白樣品經SDS-PAGE電泳分離后，用濕轉法把膠上的蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液37 ℃下封閉1 h，而后用稀釋好的目的蛋白相應一抗于4 ℃孵育過夜。用TBST洗滌膜以去除殘留未結合的一抗后，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌5次，10 min/次，加入ECL顯影劑后曝光儀成像觀察蛋白表達情況。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 阿托伐醌抑制結直腸癌細胞的增殖

MTT實驗結果顯示，阿托伐醌可增強結直腸癌SW480細胞和HCT116細胞的細胞內毒性，細胞活力下降，且呈藥物濃度依賴性(圖1A)。細胞克隆形成實驗結果顯示，隨著阿托伐醌濃度的增加，SW480細胞和HCT116細胞的克隆數逐漸減少(圖1B)。以上結果表明，阿托伐醌能抑制結直腸癌細胞的增殖，且呈濃度依賴性。

注：A：MTT實驗檢測阿托伐醌處理結直腸癌細胞后的細胞活力(與對照組相比，ns：差異無統計學意義；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；B：細胞克隆形成情況及細胞克隆數的統計(與對照組相比，**P<0.01)

2.2 阿托伐醌對結直腸癌細胞凋亡的影響

采用免疫印跡法檢測阿托伐醌處理結直腸癌細胞后凋亡相關標志蛋白的變化，實驗結果顯示，阿托伐醌處理結直腸癌SW480細胞和HCT116細胞后，Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3等凋亡相關標志蛋白的表達無明顯變化，表明凋亡不是阿托伐醌抑制結直腸癌細胞增殖的作用機制，提示阿托伐醌可能通過其他機制抑制結直腸癌細胞增殖(圖2)。

圖2 Western Blot檢測阿托伐醌處理結直腸癌細胞后凋亡相關標志蛋白的變化

2.3 阿托伐醌促進結直腸癌細胞自噬

免疫熒光實驗結果(圖3A)顯示，阿托伐醌處理結直腸癌SW480細胞和HCT116細胞后，胞內LC3熒光斑點數增加，表明阿托伐醌能促進自噬體的形成；與此同時，采用自噬阻斷劑氯喹(CQ)與阿托伐醌共處理結直腸癌細胞后，CQ與阿托伐醌共處理組的LC3熒光斑點數較阿托伐醌單獨處理組和CQ單獨處理組多，說明阿托伐醌能激活完整的自噬流。此外，蛋白免疫印跡也檢測了阿托伐醌處理細胞后自噬相關標志蛋白的變化，結果顯示，阿托伐醌處理結直腸癌SW480細胞和HCT116細胞后，自噬相關基因LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達增加，p62表達減少(圖3B)；且較阿托伐醌或CQ單獨處理，CQ與阿托伐醌共處理后LC3-Ⅱ的表達增加(圖3C)，這與免疫熒光的結果一致。以上結果表明，阿托伐醌能夠明顯激活結直腸癌細胞的自噬水平。

圖3 阿托伐醌促進結直腸癌細胞自噬

注：A：免疫熒光檢測結直腸癌細胞中的LC3熒光斑點；B：Western Blot檢測自噬相關標志蛋白的變化；C：阿托伐醌與自噬抑制劑氯喹(CQ)共處理結直腸癌細胞后檢測LC3-Ⅱ表達情況

2.4 阿托伐醌激活自噬進而抑制結直腸癌細胞增殖

采用siRNA沉默自噬相關基因Atg5后檢測阿托伐醌對結直腸癌細胞的影響，結果發現，與對照組相比， Atg5沉默組細胞活力有明顯回升(圖4A)。且與阿托伐醌單獨處理相比，3-MA與阿托伐醌的共處理組的細胞克隆數增加(圖4B)。以上結果表明，阿托伐醌能通過激活結直腸癌細胞自噬，進而抑制結直腸癌細胞增殖。

圖4 阿托伐醌激活自噬進而抑制結直腸癌細胞增殖

注：A：MTT法檢測siRNA沉默Atg5后阿托伐醌對結直腸癌細胞活力的影響(與siNC組比較，ns：差異無統計學意義,**P<0.01)；B：3-MA抑制自噬后阿托伐醌對結直腸癌細胞克隆形成的影響(與對照組相比，**P<0.01；阿托伐醌組與阿托伐醌和3-MA的共處理組相比，**P<0.01)

2.5 阿托伐醌促進ROS的產生進而激活結直腸癌細胞自噬

采用DCFH-DA探針檢測胞內ROS的表達變化，結果發現，阿托伐醌能誘發結直腸癌細胞內ROS的表達(圖5A)。且加入ROS清除劑NAC能抑制阿托伐醌誘導的結直腸癌細胞自噬(圖5B)。以上結果說明，阿托伐醌通過促進結直腸癌細胞胞內ROS的產生，從而激活細胞自噬，進而抑制結直腸癌細胞增殖。

圖5 阿托伐醌促進ROS的產生進而激活結直腸癌細胞自噬

注：A：阿托伐醌處理結直腸癌后胞內ROS的產生情況(與對照組相比，**P<0.01)；B：阿托伐醌與ROS清除劑NAC共處理結直腸癌細胞后自噬標志蛋白的變化

3 討論

結直腸癌是世界范圍內第三高發的惡性腫瘤，同肺癌、乳腺癌并列世界三大癌癥，由于結直腸癌的早期診斷較困難，加之結直腸癌具有無限增殖、侵襲和轉移等特點，所以多數結直腸癌患者在明確診斷時己經進入中晚期。盡管目前結直腸癌的治療已趨向于手術治療、輔助化療和放療的綜合療法，但其對中晚期結直腸癌患者的效果不佳，且治療后的各種并發癥發生仍然較多，因此進一步尋找治療結直腸癌的新型藥物具有重要意義。目前，較不良反應大的傳統化療藥物和研發困難的新藥相比，重新利用現存藥物并找出其新應用已成為治療腫瘤的一大新研究方向。近年來，一些美國FDA批準的抗感染藥物被研究發現具有很好的抗癌活性，其中阿托伐醌這種長期被用于抗寄生蟲的藥物就顯示出對甲狀腺癌[5]、乳腺癌[8]具有抑制作用。本研究證實了阿托伐醌能夠有效抑制結直腸癌細胞的增殖，并呈藥物濃度依賴性。腫瘤細胞常因凋亡缺陷或細胞周期異常而導致惡性增殖，激活腫瘤細胞凋亡可抑制腫瘤細胞增殖治療癌癥[9]。為研究阿托伐醌抑制結直腸癌細胞增殖的機制，本研究采用免疫印跡法檢測阿托伐醌處理結直腸癌細胞后凋亡情況的發生，結果發現Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3等凋亡相關標志蛋白的表達無明顯變化，說明阿托伐醌抑制結直腸癌細胞增殖的作用機制不是凋亡而可能是通過其他機制。

近年來，有研究[10]表明，治療腫瘤的藥物除了能引起腫瘤細胞凋亡，還可誘導其發生自噬等其他非凋亡形式的細胞死亡。自噬是一種進化上保守的細胞內自我防御機制，可清除細胞內受損的細胞器和蛋白質，并重新利用以滿足細胞本身的代謝需要[11]。自噬作為一種復雜的細胞內降解方式，在細胞死亡中具有兩重性，溫和的自噬可促進細胞存活，而過度的自噬則將誘發細胞死亡，被稱為自噬性死亡[12]。因此，自噬在抗腫瘤藥物治療中發揮著非常重要的作用。本研究采用免疫熒光和免疫印跡分別檢測了阿托伐醌處理結直腸癌細胞后自噬體的形成以及自噬相關標志蛋白的變化，結果發現，阿托伐醌處理結直腸癌細胞后，胞質中LC3熒光斑點數明顯增加，自噬相關標志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達增加，p62的表達減少，且在加入自噬抑制劑氯喹后，胞內LC3-Ⅱ的表達進一步增加，這提示阿托伐醌能促進結直腸癌細胞自噬。此外，本研究發現，在阿托伐醌處理結直腸癌細胞的同時，沉默自噬相關基因Atg5或加入自噬抑制劑3-MA可抑制阿托伐醌對結直腸癌細胞的增殖抑制作用，表明阿托伐醌是通過誘導結直腸癌細胞自噬進而抑制結直腸癌細胞增殖。

自噬能被病原體感染[13]、營養壓力[14]以及氧化應激[15]等多種刺激因素所激活。其中，活性氧成為了近年來研究的熱點。活性氧是細胞有氧代謝產生的一類性質比較活潑的含氧化合物的總稱，這些化合物會破壞不同細胞過程所必需的生物大分子，同時又在重要生物事件所需的氧化還原信號中發揮至關重要的作用[16]。研究[17]表明，過量ROS的產生能誘發氧化應激，破壞細胞內的代謝平衡，引起細胞損傷。研究[18]顯示，ROS可通過調控mTOR、p53的相關信號通路誘導自噬的發生，最終導致細胞死亡。本研究發現，阿托伐醌處理結直腸癌細胞后ROS的表達增加，且在阿托伐醌處理結直腸癌細胞的同時加入ROS清除劑NAC可抑制結直腸癌細胞自噬的發生，表明阿托伐醌能通過誘導結直腸癌細胞胞內ROS的產生進而促進結直腸癌細胞自噬。

綜上所述，阿托伐醌可通過誘導ROS介導的自噬抑制結直腸癌細胞增殖，為結直腸癌的治療提供了新的研究思路。