PI3Kγ抑制劑AS605240抗小鼠乳腺癌實驗研究*

金 科，朱劍梅，趙 丹

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院東院 腫瘤科(成都 610072)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，當前在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，發(fā)病年齡亦趨年輕化[1]。乳腺癌是一種具備局部病理特征的全身性疾病，其發(fā)病機制十分復(fù)雜，病因涉及細胞代謝、轉(zhuǎn)錄、翻譯、細胞凋亡、細胞周期調(diào)控等多種重要細胞生物學(xué)過程[2-4]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinostide 3'-kinase，PI3K)是一種細胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，同時擁有磷脂酰肌激酶和絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶活性，是多種細胞信號通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶，尤其是B 細胞受體(B-cell receptor，BCR)信號，是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)病的關(guān)鍵信號通路[5-7]。PI3Kγ在B細胞的生存分化以及功能維持方面扮演重要角色，AS605240為PI3Kγ的高度選擇性抑制劑，在多種腫瘤中被證實可促進腫瘤細胞凋亡[8-9]，但在乳腺癌中的研究還有待深入分析。本研究通過建立乳腺癌小鼠模型，探討PI3Kγ抑制劑AS605240抗小鼠乳腺癌的效果與相關(guān)機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物模型與研究材料

30只BALC小鼠購自四川醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所，小鼠周齡為3～4周，體重為15～20 g，在SPF二級動物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)；小鼠毛色均勻，反應(yīng)良好，性情溫和，無脫毛、斷尾現(xiàn)象(動物合格證號：20128903A)。4T1小鼠乳腺癌細胞株為本實驗室保存，用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，乳腺癌細胞呈ER表達陽性并HER2表達陰性。PI3Kγ選擇性抑制劑CAL-101為美國Selleck公司產(chǎn)品，MTT試劑盒購自美國Sigma公司，一抗兔抗人ERK1/2、p-ERK1/2單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，胎牛血清為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研所生產(chǎn)，TUNEL試劑盒購自Roche公司。

1.2 動物模型建立與分組

取對數(shù)生長期4T1乳腺癌細胞4×109/ mL，接種于1只BALC小鼠右側(cè)腹部，將50 μL 4T1乳腺癌細胞從皮下均勻接種到各只小鼠體內(nèi)，每兩周接種1次，待腫瘤生成停止接種，待腫瘤體長約5.0 mm3時，將符合實驗要求的小鼠隨機分為對照組、空載組與AS605240組各10只，對小鼠進行干預(yù)治療。對照組口服與AS605240組等體積DMSO；空載組口服Ad-vector、DMSO溶液各10 μL；AS605240組口服AS605240溶液10 μL。各組小鼠的干預(yù)治療實驗都采用原位多點口服形式進行，治療頻率為1次/3 d，治療觀察4周。

1.3 觀察指標

1)腫瘤體積測定：對每組各10只腫瘤小鼠進行干預(yù)治療后，每3 d對腫瘤大小進行測量，即采用游標卡尺測量腫瘤的寬徑(b)和長徑(a)，并計算腫瘤體積V=(ab2)/2。2)蛋白雜交：每組各10只小鼠實驗結(jié)束后拉頸處死，將腫瘤組織取出，裂解液處理組織，待組織充分裂解，將裂解后的混合物高速離心，獲取上清總蛋白。通過BCA試劑盒測量總蛋白濃度。取20～30 μg總蛋白進行蛋白質(zhì)印跡實驗，先進行SDS-PAGE電泳，接著通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白從PAGE膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，接著進行封閉-一抗-洗膜-二抗-洗膜過程，ECL發(fā)光法顯色，將所得的蛋白條帶圖像用Image J灰度分析軟件對其灰度值進行分析，然后以PCNA、cyclin D1、Caspase-3 蛋白條帶的灰度值作為分子，β-actin 蛋白條帶的灰度值作為分母，用兩者比值表示PCNA、cyclin D1、Caspase-3的相對表達量。選擇的抗體都為抗-PCNA、抗-CyclinD1、抗-Caspase-3。3)凋亡檢測：采用原位末端標記(TUNEL)法測定每組各10只小鼠腫瘤組織細胞凋亡情況，根據(jù)TUNEL試劑盒說明書開展實驗，并采用熒光顯微鏡下觀察實驗后結(jié)果，顯微鏡下的綠色熒光區(qū)域為凋亡細胞。4)巨噬細胞吞噬功能實驗：實驗前3 h每組中各選取2只小鼠腹腔注射6%無菌淀粉液1 mL；實驗中腹腔注射雞紅細胞1 mL，30 min后將小鼠拉頸處死，打開腹腔，取腹腔液，滴1滴0.03%冷亞甲藍溶液，進行鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腫瘤體積對比

治療后各組BALC小鼠均未死亡，AS605240組腫瘤體積為(378.41±56.11)mm3，小于空載組(2 533.42±123.33)mm3和對照組(2 440.42±186.48)mm3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=837.948，P<0.001)。空載組和對照組之間，腫瘤體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)。相對于對照組與空載組，AS605240組可觀察到巨噬細胞吞噬雞紅細胞的現(xiàn)象，且可看到部分雞紅細胞聚集到吞噬細胞附近。

2.2 腫瘤組織細胞凋亡對比

經(jīng)過檢測，治療后AS605240組(圖1C)的細胞凋亡指數(shù)為(22.81±3.12)%，高于空載組(圖1A)與對照組(圖1B)的(3.79±1.33)%和(3.29±1.92)% ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=244.587，P<0.001)。空載組和對照組之間，細胞凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)。

圖13組腫瘤細胞凋亡染色分析
注：A：空載組;B：對照組;C：AS605240組

2.3 蛋白質(zhì)印跡結(jié)果對比

經(jīng)過蛋白質(zhì)印跡檢測，與空載組、對照組對比，治療后AS605240組腫瘤組織標本的PCNA、CyclinD1、Caspase-3蛋白表達量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。空載組和對照組之間，蛋白表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2、表1)。

圖2 3組腫瘤組織的PCNA、CyclinD1、Caspase-3蛋白質(zhì)印跡分析

組別 PCNACyclinD1Caspase-3對照組1.29±0.101.19±0.111.24±0.10空載組1.31±0.131.22±0.131.31±0.07AS605240組0.94±0.06?#0.79±0.12?#0.72±0.11?#F42.59039.839115.444P<0.001<0.001<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05；與空載組比較，#P<0.05

3 討論

乳腺癌是女性的常見腫瘤，容易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，當前乳腺癌患者的治療方法普遍為手術(shù)治療與藥物治療相結(jié)合的綜合療法，這種療法顯著提高了乳腺癌患者的生存率[10]。然而部分乳腺癌接受綜合治療后，進展甚微，常常因耐藥引發(fā)死亡，因此有必要進一步研究乳腺癌治療機制，為治療提供更有效的策略[11]。作為乳腺癌綜合治療的重要組成部分，當前生物靶向治療得到了廣泛應(yīng)用，其主要是通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性改善患者預(yù)后[12-13]。

根據(jù)激酶底物、結(jié)構(gòu)以及調(diào)節(jié)亞基可將PI3K劃分為PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kγ 3種[14]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinostide 3'-kinase，PI3K)擁有磷脂酰肌激酶和絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶活性，是多種細胞信號通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶，可調(diào)節(jié)細胞生存、分化和凋亡，在乳腺癌的形成與發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15]。P13K抑制劑可避免由于抑制mTOR而產(chǎn)生Akt的反饋性激活，PI3Kγ抑制劑AS605240抑制效果顯著，其作用原理是可共價結(jié)合P13K的活性位點-833位點賴氨酸，使該氨基酸發(fā)生不可修飾，喪失功能活性[16]。且PI3K小分子抑制劑有更好的化學(xué)穩(wěn)定性，能顯著控制腫瘤誘發(fā)的血管生成和腫瘤生長[17]。迄今為止，關(guān)于PI3Kγ抑制劑AS605240對乳腺癌的作用及其機制的研究甚少。細胞學(xué)研究[18]表明，PI3K抑制劑能抑制腫瘤細胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，抑制其向基質(zhì)細胞遷移，特別是該類抑制劑還可共同抑制ERK通路，是誘導(dǎo)癌細胞凋亡的一種重要機制。另外，單核巨噬細胞系統(tǒng)具有直接吞噬和殺傷病原體和腫瘤細胞的功能，以及參與抗原加工、遞呈免疫調(diào)節(jié)的重要作用，惡性腫瘤患者的巨噬細胞吞噬功能下降。本次實驗中觀察到AS605240能增強乳腺癌小鼠的巨噬細胞吞噬功能，具體機制尚未明確，考慮在下一步研究中分析原因。本研究顯示，AS605240能抑制小鼠乳腺癌的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。從機制上分析，P13K信號功能廣泛，可抑制Forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子的功能，進而抑制PCNA細胞凋亡路徑；可抑制前凋亡蛋白caspase-3的激活，進而減緩細胞凋亡；活化的P13K可增加核轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，增加腫瘤細胞的運動；P13K信號通路可調(diào)節(jié)細胞周期活動和CyclinD1的表達，激活氧誘導(dǎo)因子-1的表達路徑，促使細胞生長紊亂[8]。

綜上所述，PI3Kγ抑制劑AS605240在體內(nèi)具有一定的抑制小鼠乳腺癌增殖的作用，可促使腫瘤組織細胞凋亡，其作用機制可能與調(diào)節(jié)PCNA、CyclinD1、Caspase-3表達有關(guān)。