不同程度臟腑虛損哮喘患者血漿左旋精氨酸和不對稱二甲基精氨酸水平以及肺功能的研究▲

劉慧芳 李風森 姜 敏

(新疆醫科大學附屬中醫醫院呼吸科，烏魯木齊市 830000，電子郵箱：huihui19830303@163.com)

支氣管哮喘(哮喘)是一種由多種細胞和細胞組分參與、以氣道慢性炎癥為特征的異質性疾病。流行病學研究表明，在許多國家和地區哮喘的患病率呈上升趨勢，特別是近二十年來其患病率和病死率均呈增加趨勢[1]。

細胞分子和動物模型研究結果均顯示，線粒體功能障礙可導致氧化磷酸化異常，從而增加細胞活性氧含量從而導致內皮細胞如血管內皮細胞受損[2]。動物實驗表明哮喘模型動物的氣道中也存在功能改變的線粒體，提示線粒體參與了氣道上皮損傷與哮喘的發病機制，即活性氧過多導致氧化/抗氧化失衡，從而引起氣道上皮細胞的氧化應激[3-5]。此外，過多的過氧亞硝酸陰離子可以通過降解細胞色素C的血紅素基團從而引起細胞損傷和線粒體功能障礙[6]。不對稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)是左旋精氨酸(L-arginin，L-Arg)甲基化后的產物，其作為內源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的抑制劑，能與L-Arg競爭性結合NOS，使NOS解偶聯從而生成過氧亞硝酸陰離子[7-8]。而L-Arg與NOS結合是降低ADMA-NOS解偶聯的有效途徑。此外，已有研究者提出血漿中L-Arg與ADMA的比值可以作為NOS功能受損的指標之一[7，8-10]。基于二者之間的關系，我們認為采用L-Arg/ADMA比值的變化來評估ADMA或L-Arg在體內的變化趨勢更有意義。

中醫認為，哮病的發生為宿痰內伏于肺，附加外感、飲食、情志、勞倦等因素，以致痰阻氣道、肺氣上逆所致。哮病的病理因素以痰為主，痰的產生責之于肺不能布散津液、脾虛不能運輸精微，腎虛不能蒸化水液，以致津液凝聚化飲成痰，內伏于肺，成為發病的“宿根”，根本因素在于肺脾腎三臟虛損。發病之初以肺虛為主，病情尚輕，以肺系功能異常為主要表現；遷延日久則可因耗傷肺氣、肺陰而累及脾臟，發展為肺脾兩虛，病情加重；隨著病情發展，最終導致肺、脾、腎三臟皆虛，以致水液代謝失常情況愈發嚴重，宿痰內伏，加之肺虛衛外不固，外邪易侵發病。病位雖在肺，但直關脾腎，且隨著臟腑虛損情況的加重，病情也隨之加重，存在著肺氣虛、肺脾氣虛、肺脾腎俱虛的證候演變,臟腑虛損狀況反映著病情嚴重程度。本研究旨在探討不同程度臟腑虛損哮喘患者L-Arg/ADMA比值和肺功能的變化情況及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年11月至2017年5月在我院門診及住院部確診為哮喘急性發作期的122例患者作為哮喘組,其中男41例，女81例；年齡17～65(48.34±10.49)歲；肺氣虛者47例，肺脾氣虛者39例，肺脾腎虛者36例。納入標準：(1)符合哮喘急性發作期的診斷標準，并能接受病情觀察和各項檢查；(2)年齡16～65歲；(3)能夠理解研究目的，并簽署知情同意書，自愿參加研究的患者。排除標準：(1)妊娠或哺乳期婦女；(2)合并肺源性心臟病、肺癌、結核、肺纖維化等其他呼吸系統疾病及呼吸衰竭接受或未接受機械通氣者；(3)任何部位惡性腫瘤、免疫性疾病、血液病、內分泌系統疾病者；(4)精神病患者或精神異常患者。選擇同期在我院進行體檢的44例健康正常人作為正常對照組。其中男15例，女29例；年齡24～64(47.66±10.89)歲，4組研究對象一般資料差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

表1 4組研究對象一般資料的比較

1.2 診斷標準

1.2.1 支氣管哮喘診斷標準：支氣管哮喘根據中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組制定的《支氣管哮喘防治指南(2016年版)》中的診斷標準[11]進行診斷。

1.2.2 中醫診斷標準及中醫臟腑虛損評定標準：參照《臨床中醫內科學》[12]中“哮病”和《中醫診斷學》[13]中“臟腑辨證”的診斷標準，并參照支氣管癥候診斷的相關文獻[14]制定。(1)肺氣虛：氣短、喘息、咳嗽，動則加重；神疲、乏力或自汗；惡風；舌質淡、苔白，脈沉細或細弱或濡緩無力。(2)肺脾氣虛：咳嗽、氣短、喘息，活動后加重，痰清稀；納呆或食少；胃脘脹滿或食后脹甚或便溏；神疲乏力，少氣懶言，面白惡風，自汗易感；舌體胖大或有齒痕，舌苔薄白或膩，脈沉細或沉緩或細弱。(3)肺脾腎虛：咳嗽、氣短、喘息，不動時即感喘，呼多吸少；腰膝酸軟，小便頻數清長，夜尿或遺尿；納呆或食少；胃脘脹滿或食后脹甚或便溏；惡風自汗，畏寒肢冷；舌質淡，舌苔白，脈沉細無力。

1.3 血漿L-Arg及ADMA的檢測

1.3.1 標本采集及處理：采集研究對象靜脈血5 ml置入乙二胺四乙酸抗凝管，哮喘患者為停用吸入性糖皮質激素7～14 d后留取標本。將標本3 500 r/min離心15 min后取上清液，分裝于EP管中，-80℃保存。

1.3.2 主要試劑和儀器：(1)L-Arg及ADMA標準品購自Sigma公司(批號：140321、140524)，13C6-L-Arg購自劍橋同位素實驗室有限公司(批號：MA01810)；甲酸、乙腈、甲醇：均為色譜純，購自Sigma公司。(2)K3型酶標儀、NanoDrop 8000型分光光度儀、Thermo Sorvall ST16型常溫離心機、Thermo Legend Micro型低溫離心機均購自Thermo Fisher Scientific公司，KD-8D型電熱恒溫培養箱購自上海精宏公司，ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀-TQ-D三重四級桿質譜系統及Waters ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(2.1×100 mm，1.7 μm)、ACQUITY UPLC?BEH C18保護柱(1.7 μm)均購自Waters公司，超濾離心管(10 000 Da)購自Millipore公司。

1.3.3 檢測方法：(1)樣品的前處理：取血漿500 μl，加入蛋白沉淀劑甲醇-乙腈(1 ∶3)溶液1 ml，渦旋2 min；常溫下1 000 r/min離心5 min，取上清約700 μl加入超濾管；常溫下10 000 r/min離心5 min；將樣品吸取至樣品瓶，待測。(2)采用高效液相聯合質譜法檢測L-Arg及ADMA水平。液相色譜條件：采用ACQUITY UPLC?BEH C18(2.1×100 mm，1.7 μm)色譜柱，以0.1%甲酸水溶液為流動相A，以0.1%甲酸甲醇溶液為流動相B，按表2的條件進行梯度洗脫，流速為0.2 ml/min，柱溫為35℃，進樣量為5 μl。質譜條件：采用ESI+正離子離子化模式,進行多反應監測，毛細管電壓2.60 kV，離子源溫度為120℃，錐孔氣流量為150 L/h，脫溶劑氣溫度為450℃，脫溶劑氣流速為500 L/h，具體參數見表3。

表2 液相梯度洗脫條件

表3 化合物測定質譜具體參數

1.4 肺功能測定 用藥前采用日本Chest公司Hi 198型肺功能測定儀對哮喘患者進行肺功能檢測，觀察指標包含1 s用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second,FEV1)、FEV1/用力肺活量的比值(FEV1/forced vital capacity ratio,FEV1/FVC)、呼氣流量峰值(peak expiratory flow,PEF)。檢查的注意事項：檢查時不用鼻呼氣，需用嘴呼吸，保證檢查過程中不漏氣。

1.5 統計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以例數(百分比)表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 哮喘組與正常對照組血漿ADMA、L-Arg水平及L-Arg/ADMA比值比較 兩組的血漿ADMA水平差異無統計學意義(P>0.05)，哮喘組的L-Arg水平及L-Arg/ADMA比值均低于正常對照組(均P<0.05)，見表4。

表4 哮喘組與正常對照組血漿ADMA、L-Arg水平及L-Arg/ADMA比值比較(x±s)

2.2 不同程度臟腑虛損哮喘患者肺功能比較 肺氣虛組、肺脾氣虛組、肺脾腎虛組患者FEV1、FEV1/FVC、PEF均依次降低(均P<0.05)，見表5。

表5 不同程度臟腑虛損哮喘患者肺功能比較(x±s)

注：兩兩比較，均P<0.05。

2.3 不同程度臟腑虛損哮喘組與正常對照組血漿L-Arg、ADMA水平、L-Arg/ADMA比值比較 各臟腑虛損組的L-Arg水平、L-Arg/ADMA比值均低于正常對照組(均P<0.05)，但不同臟腑虛損哮喘組間比較差異均無統計學意義(均P>0.05)。4組的ADMA水平差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表6。

表6 不同程度臟腑虛損哮喘患者與正常對照組血漿L-Arg、ADMA水平及L-Arg/ADMA比值比較(x±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.05。

3 討 論

目前，有研究表明在心血管疾病等多種其他疾病中ADMA水平的升高可導致細胞線粒體功能受損[15-18]。1型和2型糖尿病大鼠的血漿ADMA含量明顯升高，而反映心肌線粒體細胞色素C氧化酶與線粒體合成的關鍵調節因子——過氧化物酶體增殖物活化受體γ共激活因子-1α轉錄明顯減少；老年大鼠血漿內源性ADMA水平升高，伴心肌線粒體生物合成減少，且兩者呈負相關，而外源性ADMA可直接抑制心肌細胞線粒體生物合成與三磷酸腺苷生成[19-20]，提示ADMA能導致心肌組織線粒體生物合成障礙，這與ADMA水平的升高而引起L-Arg/ADMA比例下降有關。

本研究結果顯示，哮喘組血漿L-Arg水平及L-Arg/ADMA比例低于正常對照組(均P<0.05)，且各臟腑虛損組的L-Arg水平、L-Arg/ADMA比值亦均低于正常對照組(均P<0.05)。提示不同臟腑虛損的哮喘患者機體均存在精氨酸代謝紊亂、L-Arg/ADMA比例的失衡和NOS功能的受損，而這可能會影響線粒體功能。當L-Arg水平下降時，L-Arg/NOS/NO通路(即NO的生成過程)的底物缺乏或不足，而由于L-Arg和ADMA存在相互競爭結合NOS的關系，此時ADMA處于相對剩余狀態，那么作為限速酶的NOS不能夠充分與L-Arg結合發揮其功能生成NO，就會被ADMA解耦聯產生大量的過氧亞硝酸陰離子而損傷線粒體呼吸鏈。并且目前相關研究已表明哮喘患者血漿NOS水平升高[21]，但正是由于L-Arg的不足而被大量解耦聯，L-Arg/ADMA比例的失衡正是反映了NOS的功能受損。因此，我們認為L-Arg/ADMA比例下降是引起哮喘患者線粒體呼吸鏈損傷、大量活性氧蓄積的重要原因；而造成哮喘患者機體內L-Arg/ADMA比例失衡的根本原因可能是L-Arg的不足。但在本研究中，不同程度臟腑虛損哮喘患者精氨酸的代謝水平差異無統計意義。

中醫臟腑虛損理論認為肺脾腎三臟虛損與哮喘發病的輕重程度密切相關，臟腑虛損狀況反映著病情嚴重程度，從發病之初的咳喘到呼吸衰竭的病情進展過程中，存在著肺氣虛、肺脾氣虛、肺脾腎俱虛的證候演變和臟腑傳變規律，臟腑虛損狀況和傳變規律在某種程度上反映了病情的進展趨勢[22-24]。本研究中，肺氣虛組、肺脾氣虛組、肺脾腎虛組患者FEV1、FEV1/FVC、PEF均依次降低(均P<0.05)，即隨臟腑虛損情況的加重，哮喘患者的肺功能下降。這提示肺脾腎三臟虛損狀況反映著病情的進展趨勢，用臟腑虛損理論對臨床癥狀等外在表象的判斷進行辨證分型對哮喘患者臨床病情進展的估測有一定的可行性。

總之，不同程度臟腑虛損哮喘患者機體均存在精氨酸代謝紊亂、L-Arg/ADMA比例的失衡，這可能是引起哮喘患者線粒體呼吸鏈損傷、大量活性氧蓄積的重要原因；但不同程度臟腑虛損哮喘患者精氨酸的代謝水平并無差異。哮喘患者肺功能變化與臟腑虛損發展趨勢具有一致性。