幽門螺桿菌感染胃組織基因芯片生物信息學(xué)分析

付 偉,謝 東,班春梅,鄧亞婕,代 芳,王 松,曹 潔

(解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì) 第925醫(yī)院消化血液科，貴陽(yáng) 550009)

目前幽門螺桿菌感染(Helicobacter pylori，HP)已經(jīng)非常常見(jiàn)，平均大約50%的人群有感染[1]，特別是在貧困地區(qū)，因?yàn)樽匀画h(huán)境、飲食衛(wèi)生條件、及民俗習(xí)慣等感染率會(huì)更高。HP感染者可能會(huì)導(dǎo)致慢性活動(dòng)性胃炎，糜爛性胃炎，以及消化道潰瘍等消化道疾病，甚至造成食管腺癌，胃萎縮，胃癌和結(jié)直腸癌的潛在治病因素[2]。目前對(duì)于HP感染已經(jīng)有多種根治治療方案，但由于耐藥菌的增多，部分患者效果較差[3]。同時(shí)一部分感染者并不是都會(huì)出現(xiàn)炎性改變或者癌變，為了認(rèn)識(shí)HP感染對(duì)于胃粘膜組織損傷的分子機(jī)制，設(shè)計(jì)了對(duì)于HP相關(guān)芯片的生物信息學(xué)分析。

1 材料和方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)來(lái)源

從GEO網(wǎng)站下載相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)(GSE5081)[4]。該芯片使用微陣列比較了HP陽(yáng)性和HP陰性胃糜爛和正常相鄰粘膜的全基因組基因表達(dá)譜，對(duì)HP感染后mRNA表達(dá)模式進(jìn)行分析。從8例HP陰性糜爛性胃竇炎患者和8例HP陽(yáng)性糜爛性胃竇炎患者的冷凍活檢標(biāo)本中提取總RNA。同時(shí)，從所有16名患者的鄰近(距離侵蝕至少3 cm)肉眼可見(jiàn)的正常竇腔樣品取樣。其中本研究涉及HP陰性患者包括三名男性患者和五名女性患者，年齡為50～88歲(中位數(shù)67.5歲)。組織學(xué)炎癥程度輕度6例，中度2例。其中兩人患有腸化生。本研究涉HP陽(yáng)性感染者年齡為32～75歲(中位數(shù)58.5歲)，5名男性和3名女性患者。組織學(xué)炎癥程度輕度3例，中度1例，嚴(yán)重4例。其中兩人有中度萎縮，一人有局灶性腸化生。在內(nèi)鏡檢查時(shí)，沒(méi)有患者接受質(zhì)子泵抑制劑或抗生素治療。所有患者屬于高加索人種族。他們都沒(méi)有吸煙，還有其他已知的疾病。

1.2 芯片數(shù)據(jù)生物信息分析

首先芯片的質(zhì)量評(píng)估[5]，通過(guò)分組差異基因的篩選[6]，并功能分析、注釋。把組織樣本分為4組，A) ER(+)HP(+),B) ER(+)HP(-),C) ER(-)HP(+),D) ER(-)HP(-),其中HP為幽門螺桿菌，而ER為損傷粘膜組織。分別分析受損組織，健康組織組內(nèi)的HP感染與否的差異基因變化，最后合并分析。具體是A、B組進(jìn)行了差異分析得到分析結(jié)果差異分析1。C、D組進(jìn)行了差異分析得到分析結(jié)果差異分析2(Q值<0.05，F(xiàn)oldchange≥1.2，閾值設(shè)定為分析軟件推薦值)。將兩組獲得的差異基因取并集，隨后進(jìn)行GO分析、通路分析，以及基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證

收集2016年1月至2016年6月，在解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第925醫(yī)院 C14尿素氮呼氣試驗(yàn)陽(yáng)性者(CPM>100)為感染者，檢測(cè)陰性者為健康對(duì)照各10例，考慮診斷為慢性糜爛性胃炎，并且在內(nèi)鏡檢查時(shí)，沒(méi)有接受質(zhì)子泵抑制劑或抗生素治療，排除其他疾病。感染者與對(duì)照組一般臨床特征無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，均取受損黏膜組織，在獲取胃黏膜組織后，使用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。 cDNA被適當(dāng)稀釋并用于PCR。使用SYBR Premix EX Taq(TAKARA)和ABI PRISM 7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，Life Technologies，Carlsbad，CA)以β-actin作為參考對(duì)照，一式三份進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。引物由上海生工公司合成，CXCR4 引物上游：5’-CCTATGCAAGGCAGTCCATGT-3’，下游：5’CCTATGCAAGGCAGTCCATGT 3’，內(nèi)參基因β-actin 引物：上游：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA -3’，下游：5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’。CXCL2上游引物:CGCAGCAGGAGCGCC 下游引物: TGGATGTTCTTGAGGTGAATTCC CXCL5 上游引物:GGAAGGAAATTTGTCTTGATCC 下游引物: TTTCCTTGTTTCCACCGTC。參與本研究的所有HP感染患者和正常人均已簽署知情同意書，并通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

差異基因篩選主要利用文獻(xiàn)的常用方法(Significance Analysis of Microarray，SAM)。兩組間計(jì)量資料采用使用T檢驗(yàn)(平均數(shù)±SD)，計(jì)數(shù)采用卡方檢驗(yàn)，p<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。統(tǒng)計(jì)及分析軟件使用spss23，以及GCBI在線實(shí)驗(yàn)室分析軟件。

2 結(jié)果分析

2.1 芯片質(zhì)量分析

總樣本數(shù)量共31個(gè)。對(duì)獲得的樣本，首先進(jìn)行質(zhì)量分析，每張芯片的RLE(Relative Log Expression)計(jì)算了芯片信號(hào)值估計(jì)在整體芯片中的相對(duì)變化率，進(jìn)而反映了所檢測(cè)基因的變化特征。本芯片RLE一致性較高，芯片本身質(zhì)量無(wú)問(wèn)題(見(jiàn)圖1)。質(zhì)量較高的芯片，才有必要進(jìn)行下一步的研究分析，否則需要舍去不合格的樣本。

圖1 基因芯片質(zhì)量分析箱形圖Fig.1 Quality analysis box chart

2.2 差異基因篩選

應(yīng)用SAM法[7]分析在預(yù)先設(shè)定的分組下篩選具有顯著性差異的基因。通過(guò)分析A，B組，得到在受損的胃粘膜組織，HP(+)vs HP(-)的差異基因1，共28個(gè)(見(jiàn)圖2)。

通過(guò)分析C，D組，我們得到在健康的胃粘膜組織，HP(+)vs HP(-)的差異基因(見(jiàn)圖3)，共27個(gè)。同時(shí)兩個(gè)差異基因集取并集獲得上調(diào)差異基因44個(gè)。提示在HP感染后，這些基因的高表達(dá)與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

2.3 功能分析

基因功能注釋的目的是發(fā)現(xiàn)這些差異基因在生物學(xué)功能，代謝途徑中的地位和意義，研究基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，及其功能機(jī)制。Go分析[8]發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要涉及免疫反應(yīng)，炎癥反應(yīng)，抗原提呈，細(xì)胞間信號(hào)通路等，而KEGG信號(hào)通路分析[9]，主要包括：細(xì)胞因子信號(hào)通路，因子受體相互作用，細(xì)胞粘附等通路。

2.4 核心節(jié)點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)分析

基因相互作用(Gene signal network)分析解構(gòu)了KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，突破限制獲得單一信號(hào)通路中基因之間的相互作用。因此，可以獲得一些基因的上下游分子關(guān)系。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)差異基因的相互作用：CXCR4,CCL20,CXCL13,CXCL3,CXCL5,CXCL2,HLA-DMA,HLA-DQA1,HLA-DPA1,HLA-DOA,HLA-DQB1存在有網(wǎng)絡(luò)作用，其中核心分子為CXCR4(見(jiàn)圖4)。

圖2 A、B組差異分析1聚類分析和火山圖Fig.2 Cluster analysis chart of Group A and B, volcano map in DEG1

注：(a)中紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因(顏色詳見(jiàn)電子版http://swxxx.alljournals.cn/ch/login.aspx.(2019年第1期))；(b)中橫坐標(biāo)代表差異倍數(shù)，縱坐標(biāo)代表P值均取log

圖3 C、D組差異分析2聚類分析和火山圖Fig.3 Cluster analysis chart of Group C and D volcano map in DEG2

共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)清楚的揭示了兩基因之間的關(guān)系，并找到調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵基因。這是通過(guò)基因間相關(guān)系數(shù)來(lái)擬合基因無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)關(guān)系實(shí)現(xiàn)的。分析基因共表達(dá)得到CCL20，PLEK，HLA-DMA，JAK3，BCL2A1，TNFAIP2，CXCL13，PTPRC，CXCL3，F(xiàn)GR，F(xiàn)AM65B，C3，CXCL5，MMP9，VNN2，ADAMDEC1，GZMK,TLR10之間共表達(dá)關(guān)系，其中重要的節(jié)點(diǎn)分子為CCL20，JAK3，TNFAIP2，PLEK，HLA-DMA，PTPRC，CXCL13，BCL2A1(見(jiàn)圖5)。

2.5 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證相關(guān)基因表達(dá)

通過(guò)實(shí)施定量PCR方法，驗(yàn)證在感染后的胃黏膜組織部分相關(guān)基因的表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)CXCR4,CXCL5,CXCL2在HP陽(yáng)性的胃黏膜組織表達(dá)高于HP陰性對(duì)照組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖6)。

表1 主要涉及GO基因分類(前10)Table 1 Top 10 GO mainly involved gene classification

表2 主要涉及的信號(hào)通路(前10)Table 2 Top 10 mainly involved signaling pathway

圖4 基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Gene interaction network diagram

圖5 基因共表達(dá)分析網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 5 Gene co-expression network diagram

圖6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CXCR4,CXCL5,CXCL2在胃黏膜組織中的表達(dá)(*提示P<0.05)Fig. 6 Real-time quantitative PCR detection of CXCR4, CXCL5, and CXCL2 expression in gastric mucosa

3 討 論

幽門螺旋桿菌是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，最初是由Warren和Marshall于1983在胃上皮的管腔表面發(fā)現(xiàn)，并分離出來(lái)，從第一次發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌，研究其與臨床消化道疾病關(guān)系以來(lái)，已經(jīng)經(jīng)歷三十多年[10]。 絕大多數(shù)HP感染患者不會(huì)有任何臨床意義上的表現(xiàn)，僅僅在部分患者當(dāng)作引起消化道疾病治病因素，其中毒力因子空泡毒素(VacA)[11]，細(xì)胞毒素相關(guān)基因A (CagA)[12]被認(rèn)為是重要的治病因素。為了認(rèn)識(shí)該細(xì)菌，以及了解其致病機(jī)制，做了許多研究，包括體內(nèi)以及體外研究。

目前發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌與消化道疾病關(guān)系緊密，但同時(shí)與心血管疾病，貧血，腦梗，糖尿病等疾病均有關(guān)聯(lián)[13-16]。為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)幽門螺桿菌對(duì)胃粘膜組織的分子層面影響，分析幽門螺桿菌相關(guān)芯片。Go分析：主要涉及免疫反應(yīng)，炎癥反應(yīng)，抗原提呈，細(xì)胞信號(hào)通路等。Pathways通路分析：提示主要涉及的信號(hào)通路包括：細(xì)胞因子通路，因子受體關(guān)聯(lián)，細(xì)胞粘附分子等。

基因相互作用分析中發(fā)現(xiàn)重要的CXCR4基因，與趨化因子的互相作用，在人類發(fā)育、免疫應(yīng)答、癌轉(zhuǎn)移均起到了重要的作用。已經(jīng)有臨床研究證明CXCR4在HP患者當(dāng)中高表達(dá)[17]，部分的HP感染患者可能會(huì)引起消化道腫瘤，CXCR4與消化道腫瘤的高表達(dá)有關(guān)系[18]，這是否和CXCR4的過(guò)度激活有關(guān)？同時(shí)在已有研究中發(fā)現(xiàn)胃淋巴瘤觀察到CXCR4和Ki-67表達(dá)之間的相關(guān)性，并提示CXCR4可作為診斷和治療MALT型胃淋巴瘤潛在靶點(diǎn)[19]。不僅如此，近年來(lái)研究表明在慢性幽門螺桿菌感染過(guò)程中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移到胃組織，也可能是胃腺癌的起源[20]。

基因共表達(dá)分析中重要的節(jié)點(diǎn)分子為趨化因子CCL20[21]，CXCL13[22]，CXCL5[23]，CXCL2[24]以及其他包括增殖，炎癥，免疫，凋亡相關(guān)重要分子JAK3,TNFAIP2,PLEK,HLA-DMA,PTPRC,BCL2A1的激活，而這些基因與胃癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[25-28]。有研究證實(shí)幽門螺桿菌誘導(dǎo)的STAT3激活直接上調(diào)JAK3，可能有助于胃癌的發(fā)生和發(fā)展[25]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證分析相關(guān)分子的表達(dá)情況，進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，CXCR4，CXCL5，CXCL2在幽門螺桿菌感染后的胃黏膜組織均高于對(duì)照組，更多的機(jī)制探討需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

幽門螺桿菌感染后，存在多個(gè)信號(hào)通路的激活，包括炎癥，免疫反應(yīng)，細(xì)胞凋亡信號(hào)，而后出現(xiàn)組織細(xì)胞修復(fù)、增殖活化等。而這些在組織細(xì)胞間異常表達(dá)的基因，提示我們是否可能通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路藥物，從而避免幽門螺桿菌感染所造成的嚴(yán)重后果，同時(shí)也給我們提供了進(jìn)一步研究的方向。