MiR-514與胃癌細胞凋亡的關系及機制

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凋亡異常是腫瘤細胞生存能力強的重要因素，許多惡性腫瘤細胞都具有較強的凋亡抵抗能力，這種能力使癌細胞具有較強的生存能力，導致腫瘤進展[1]。胃癌是我國常見的惡性腫瘤，發病率、死亡率居于我國惡性腫瘤第2位[2]，對人民危害極大。胃癌具有進展迅速、生長快的特點，患者的綜合治療效果不佳，預后較差[3]。胃癌具有這些惡性生物學特點其中重要原因在于胃癌細胞具有較強的凋亡抵抗能力，這種能力使胃癌細胞存活能力強，從而導致腫瘤進展[4]。因此，如果能夠逆轉胃癌細胞的凋亡抵抗能力，使其易于凋亡，則有可能抑制腫瘤的進展，從而改善治療效果及預后。近期通過促進腫瘤細胞凋亡而抑制腫瘤進展的研究已成為本領域研究的熱點，但迄今為止尚未取得突破性進展。

胃癌細胞的凋亡是由多種基因、通路等共同作用而導致的，腫瘤細胞的凋亡情況是這些因素共同作用的結果[5]。近年來，有關微小RNA(microRNA,miRNA)與腫瘤關系的研究越來越受到關注。MiRNA是一種由22～28個堿基組成的單鏈核苷酸，在細胞內基因的轉錄調控過程中發揮了重要作用[6]。研究發現miRNA與胃癌關系密切，在胃癌的增殖、侵襲、凋亡過程中都發揮了重要作用[7-9]。MiR-514是miR家族的成員之一，有研究表明，miR-514在腎癌組織中表達降低，具有抑癌基因的功能[10]。但miR-514在胃癌中的表達情況還未見報道，miR-514在胃癌中是否發揮了作用及其機制也不明確。本研究分析miR-514表達與胃癌細胞凋亡的關系及其作用機制，為胃癌治療新靶點的闡明做出貢獻。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月—2017年10月在河北醫科大學第四醫院普通外科住院并手術的胃癌患者80例，均經開腹或腹腔鏡手術切除原發病灶。取新鮮的胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織標本，置于液氮保存。患者中男性58例，女性22例；患者年齡36～80(61.4±10.3)歲。腫瘤長徑≥5 cm者53例，<5 cm者27例；腫瘤浸潤位于漿膜內者42例，浸潤達漿膜外者38例；根據國際抗癌聯盟第8版TNM分期標準，Ⅰ、Ⅱ期者27例，Ⅲ、Ⅳ期者53例；腫瘤為中高分化者43例，低分化者37例；淋巴結轉移陽性者61例，陰性者19例；有遠處轉移者9例，無遠處轉移者71例。患者手術前均未接受過化療、放射治療、靶向治療等針對胃癌的治療。患者不合并嚴重免疫系統疾病、嚴重感染及其他惡性腫瘤。研究經河北醫科大學第四醫院醫學倫理委員會批準并取得患者的知情同意。

1.2 細胞株及主要試劑 人低分化細胞株MGC803購自中國科學院上海典型物保藏中心，于河北醫科大學第四醫院科研中心保種傳代。MiR-514、Bcl-2、Bax、x連鎖凋亡抑制蛋白(x-linked inhibitor of apoptosis protein, xIAP)及內參照基因U6、GAPDH的引物序列由上海生工生物公司合成。miR-514模擬物及陰性對照序列由美國Ambion公司合成。TaqMan Real-Time PCR試劑盒為美國Applied Biosystems公司產品。PCR試劑及反轉錄試劑盒為美國Invirtogen公司產品。噻唑藍(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)為美國Sigma公司產品。實時定量聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)儀(AB-7900型)為美國Thermo Fisher公司產品。

1.3 RT-PCR技術檢測miR-514及Bcl-2、Bax、xIAP表達水平 分別從組織及細胞株中提取總RNA，測定其濃度及純度。測定完畢后進行逆轉錄實驗合成各靶基因的cDNA單鏈。然后取2 μL的cDNA進行PCR反應。檢測miR-514應用TaqMan RT-PCR試劑盒，嚴格按試劑盒指示說明進行操作，以U6為內參照基因。Bcl-2、Bax、xIAP的基因檢測應用PCR試劑盒按說明書進行操作。建立20 μL的PCR體系，包括10 μL of 2×miRcute miRNA Premix(檢測miR-514)或SYBR Green Mix(檢測Bcl-2、Bax、xIAP基因)、上下游引物各0.5 μL、2 μL反轉錄產物、DEPC處理水7 μL。進行PCR循環，共進行40個循環。2-ΔΔCt法計算目的基因的表達水平，以目的基因的表達水平與內參照基因的表達水平的比值代表目的基因表達強度。

1.4 細胞培養及miR-514模擬物轉染、分組 MGC803細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，2～3 d傳代一次，當細胞處于生長期，融合達到60%～70%時進行后續實驗。細胞分為不轉染組(空白組)、miR-514模擬物轉染組(轉染組)及陰性對照序列轉染組(陰性組)。按操作說明進行轉染，于轉染后48 h進行后續實驗。

1.5 MTT法檢測各組細胞活性 各組MGC803細胞調整濃度接種于96孔板，每孔接種細胞為1×105個，繼續培養細胞至附壁。實驗結束前4 h向各孔內加入濃度為5 mg/mL的MTT共20 μL，繼續培養4 h棄去培養液，然后在每孔內加入150 μL的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)。震蕩15 min后用酶標儀在450 nm處讀數，用光密度值(optical density, OD)代表細胞的活性。實驗重復3次。

1.6 流式細胞術檢測胃癌細胞的凋亡率 各組MGC803細胞轉染后48 h進行流式細胞術檢測。以磷酸鹽緩沖液漂洗、胰酶消化后收集細胞，將細胞濃度調整為5×105/mL加入到500 μL緩沖液中。分別加入10 μL of Annexin V-FITC和10 μL of Pl染液，繼續孵育15 min。將樣品上機檢測，每個樣品檢測105個細胞。計算細胞的凋亡率。實驗重復3次。

2 結果

2.1 胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織miR-514的表達 胃癌組織中miR-514的相對表達量為(0.3619±0.2103)，癌旁正常胃黏膜組織miR-514的相對表達量為(0.6943±0.3032)。胃癌組織中miR-514水平明顯低于癌旁正常胃黏膜組織(t=-8.0573,P<0.001)。

2.2 胃癌組織中miR-514表達強度與患者臨床病理特征的關系 MiR-514表達與腫瘤的淋巴結轉移有關(t=-2.5620,P=0.0123)，與性別、年齡、腫瘤長徑、浸潤深度、TNM分期、分化程度、遠處轉移情況均無關(P>0.05)。表1。

表1 胃癌組織中miR-514表達水平與臨床病理特征的關系

例數(n)miR-150表達水平性別 男580.3697±0.2139 女220.3414±0.2037年齡 ≥60歲490.3562±0.1945 <60歲310.3708±0.2362腫瘤長徑 ≥5 cm530.3768±0.2105 <5 cm270.3326±0.2108浸潤深度 漿膜內420.3336±0.1991 漿膜外380.3931±0.2204TNM分期 Ⅰ～Ⅱ期270.3240±0.2119 Ⅲ～Ⅳ期530.3812±0.2088分化程度 中高分化430.3525±0.2265 低分化370.3728±0.1922淋巴結轉移 陽性610.3294±0.2084 陰性190.4662±0.1850遠處轉移 有90.3552±0.1924 無710.3627±0.2137

2.3 MiR-514轉染對人胃癌細胞株MGC803活性的影響 MiR-514模擬物轉染人胃癌細胞株MGC803后48 h檢測，轉染組細胞活性(0.522±0.062)，陰性組細胞活性(1.108±0.145)，轉染組細胞的活性明顯降低(P<0.05)。圖1。

注:?與陰性組比較,P<0.05圖1 miR-514模擬物轉染對人胃癌細胞株MGC803活性的影響

2.4 MiR-514轉染對人胃癌細胞株MGC803凋亡的影響 MiR-514模擬物轉染人胃癌細胞株MGC803后細胞的凋亡率明顯增高(F=36.451,P<0.001)。表2、圖2。

表2 各組人胃癌細胞株MGC803凋亡率情況

圖2 各組人胃癌細胞株MGC803的凋亡情況(流式細胞術結果)

2.5 MiR-514轉染對人胃癌細胞株MGC803凋亡相關基因Bcl-2、Bax、xIAP的影響 轉染后凋亡相關基因Bcl-2、xIAP的mRNA和蛋白表達明顯降低，而Bax的mRNA和蛋白表達明顯增高(均P<0.05)。圖3。

注：*與陰性組和空白組相比，P<0.05圖3 各組細胞Bcl-2、Bax、xIAP基因mRNA和蛋白表達水平

3 討論

胃癌是我國的高發惡性腫瘤之一，居各種惡性腫瘤發病率的第3位[11]。近年來發病率雖然略有下降，但總體療效并未獲得明顯改善，5年生存率一直在30%左右。迄今為止，外科手術仍被認為是治療胃癌的最主要手段，但其復發與轉移是導致治療失敗的主要原因，也是胃癌患者的主要死因[12-13]。胃癌進展迅速的重要原因之一在于胃癌細胞具有較強的凋亡抵抗能力，這種能力使胃癌細胞易于存活，難以被機體自身的抗體或外界的藥物殺滅，進而導致腫瘤進展。目前研究已證實胃癌細胞對鉑類化療藥物的耐藥形成主要來源于其具有的凋亡抵抗能力[14]，胃癌細胞的這種能力嚴重影響化療效果。因而近年來調控胃癌細胞凋亡已成為胃癌治療領域的一個熱點。由于胃癌細胞的凋亡調控是由包括多種基因、通路蛋白、miR、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)等多種分子互相作用而形成的網絡式調控體系共同決定的，其機制復雜，迄今尚未找到在網絡中存在的關鍵分子，因而胃癌凋亡調控也未取得突破性進展。

在參與胃癌基因調控的分子中，近年來miR已受到越來越多的關注，并在胃癌研究中取得了很多成果。MiR屬于一類小RNA(small RNA)，一般長約22～28個核苷酸，不編碼蛋白質；它普遍存在于生物界，具有保守性﹑基因簇集現象和時空特征等生物學特性。MiR的作用極為廣泛，參與了生物體的各種生命現象，如發育﹑細胞分化﹑增殖和凋亡途徑[15]。miR的作用在于它能調控成組的靶基因，因而與單個基因相比，miR具有更為強大的調控功能。迄今已發現多種miR在胃癌中存在異常表達并發揮了重要作用。研究發現miR-30可以通過調節胃癌細胞的自噬功能而減弱其耐藥性[16]。MiR-203a可以通過轉錄調控抑制胃癌細胞的增殖[17]。還有研究發現miR-93可以促進胃癌的侵襲[18]。這些研究表明miR在胃癌中發揮了廣泛的調控作用，且作用的方式多樣，有的具有原癌基因的功能，有的具有抑癌基因的作用。深入研究miR在胃癌中的作用效果及機制有良好的前景。本研究中的miR-514也是近年來發現與腫瘤密切相關的miR之一，在腎透明細胞癌中表達降低，可能參與了腫瘤的侵襲轉移過程[19]。本研究結果顯示，miR-514在胃癌組織中的表達水平比癌旁組織明顯減低，提示miR-514的表達缺失可能是胃癌發生及進展的原因。進一步研究發現，miR-514表達與腫瘤的淋巴結轉移有關，存在淋巴結陽性轉移的患者胃癌組織中miR-514表達更低，說明miR-514在胃癌的進展中發揮了作用，有可能成為胃癌新的治療靶標志。

有關miR-514在胃癌中作用的具體調控機制還不明確，因此我們進一步檢測了在胃癌細胞株MGC803中過表達miR-514后細胞凋亡能力的改變。結果發現，轉染miR-514模擬物后MGC803細胞的凋亡率明顯升高，提示miR-514可能是通過調控胃癌細胞凋亡而發揮作用。Bcl-2是細胞線粒體凋亡途經中的主要基因，其主要功能是維持細胞穩定、減少凋亡[20]。Bcl-2在細胞中可以通過多種途徑發揮其凋亡抵抗作用，在腫瘤中Bcl-2存在表達增高現象，是腫瘤細胞產生凋亡抵抗的重要原因[21]。Bax則是促進腫瘤細胞凋亡的重要基因，其主要作用是與Bcl-2結合成為二聚體，其中二者的比例決定了腫瘤細胞的凋亡程度[22]。在腫瘤細胞凋亡調控的研究中，選用合適的方法促進Bax表達、從而促進腫瘤細胞凋亡是目前研究的一個重要領域。xIAP是凋亡抑制蛋白家族中的重要成員之一，具有類似鋅指的結構，在多種腫瘤組織中廣泛表達，其作用主要是通過直接或間接的作用調控caspase家族中的casepase-3、7、8、9而抑制細胞凋亡，使腫瘤細胞產生凋亡抵抗[23]。進一步檢測miR-514模擬物轉染前后MGC803細胞中凋亡相關基因Bcl-2、Bax、xIAP的表達情況。本研究結果顯示，轉染miR-514模擬物后MGC803細胞中Bcl-2、xIAP的mRNA表達明顯降低，而Bax的mRNA表達明顯增高，提示miR-514通過調控這些基因的轉錄而發揮了作用，但具體的機制還需要深入研究。

本研究發現miR-514在胃癌組織中存在表達減低的現象，與胃癌患者的淋巴結轉移情況有關。miR-514可能通過調控Bcl-2、Bax、xIAP的轉錄而使細胞出現凋亡抵抗，從而抑制胃癌細胞凋亡、促進胃癌進展。本研究初步證實了miR-514在胃癌凋亡過程中的調控作用，但研究還不夠深入，需要進一步的動物實驗予以證實，還需要全面的分子間調控研究進行分析。