端粒重復序列結合因子1和2在口腔黏膜癌組織中的表達及臨床意義

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口腔黏膜癌是指發生于口腔黏膜的鱗狀細胞癌，約占口腔惡性腫瘤的90%，臨床治療以手術和放療為主，但因其具有高轉移率和高復發率的特點，這些治療手段并不十分理想[1-2]。目前國內外關于口腔黏膜癌發病的分子機制研究較多，其中一個重要機制與端粒功能失調密切相關[3]。端粒是細胞內染色體末端維持染色體結構完整性的重要結構，其功能失調與許多癌癥的發生、發展有著密切的關系[4]。端粒重復序列結合因子(telomere repeat binding factor,TRF)1與TRF2是當前醫學生物學研究領域的熱點之一。許多研究表明TRF1與TRF2是端粒雙鏈DNA 2種重要的結合蛋白，TRF1對端粒長度具有負調控作用，而TRF2則參與維持端粒結構的完整性與維持基因組的穩定性[5-7]。本研究通過檢測正常組織、癌旁組織和腫瘤組織中TRF1、TRF2蛋白表達水平的變化，探討TRF1、TRF2蛋白表達與口腔黏膜癌病變的關系，為臨床治療提供相關參考依據。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集2012年7月—2016年7月武漢大學人民醫院收治的48例口腔黏膜癌患者癌組織和癌旁組織(距病灶1～2 cm)標本，其中男性33例，女性15例;年齡42～75(53.6±4.9)歲。所有病例均經手術病理檢查證實為口腔黏膜癌。所有患者研究前均未接受放療與化療等相關治療，具備完整的臨床病理資料，并簽署研究知情同意書。根據腫瘤細胞的分化程度將組織塊分為高分化組13例，中分化組19例和低分化組16例。此外選擇32例正常口腔軟組織塊標本作為正常對照組。上述所有標本經過4%多聚甲醛固定，行石蠟包埋、切片(3～4 μm)，分別進行蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色與免疫組化分析。

1.2 免疫組化 一抗:TRF1、TRF2抗體均為美國Santa Cruze Biotechnology公司產品；二抗：免疫組織化學SP試劑盒購自福建邁新生物技術公司。嚴格按照試劑盒說明書中步驟進行免疫組織化學染色。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定 免疫組化結果按參考文獻[8]進行判定：TRF1與TRF2的陽性反應表現為細胞核或細胞漿呈現棕黃色或更深顏色顆粒。切片的陽性細胞數采用3分制計分：切片未見染色，為陰性，計0分；輕度染色計1分；中度染色計2分；深度染色計3分。另外，陽性細胞率仍采用3分制：無陽性細胞計0分；陽性細胞<20%計1分；陽性細胞在20%～50%間計2分；陽性細胞>50%計3分。將陽性細胞數及陽性細胞率所得評分相乘得到免疫組織化學評分。陰性為0～3分；弱陽性(+)4～5分；中度陽性(++)6～7分；強陽性(+++)8～9分。

1.4 統計學處理 應用SPSS 22.0軟件進行處理分析。計數資料采用χ2檢驗進行統計分析，以P<0.05為差異比較有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果及TRF1、TRF2在不同組織中的表達情況 HE染色結果表明，口腔黏膜正常組織細胞增殖緩慢(圖1A)，而在口腔黏膜癌組織則發現大量的癌細胞密集聚集(圖1B)。免疫組化結果顯示，TRF1蛋白主要定位于細胞漿，在癌組織中的表達明顯低于正常組織(圖1C、圖1D)。TRF2蛋白則在細胞漿和細胞核有不同程度表達，但在癌細胞中主要集中于細胞核。從表1可見，在癌組織中TRF1陽性率顯著低于癌旁組織和正常組織(χ2=6.147，P=0.007)；而在癌旁組織與正常組織間差異比較無統計學意義(χ2=4.775，P=0.065)。TRF2陽性率在癌組織中顯著高于癌旁組織和正常組織(χ2=20.003，P=0.007)，而在癌旁組織與正常組織間差異比較無統計學意義(χ2=8.054，P=0.059)。

A：口腔黏膜正常組織HE染色結果；B：癌組織HE染色結果；C：癌組織中TRF1免疫組化結果；D：口腔黏膜正常組織中TRF1免疫組化結果圖1 HE染色及免疫組化染色結果

蛋白組織類型-++++++總陽性率(%)口腔黏膜癌組織21518456.20? TRF1癌旁組織161013966.67正常口腔軟組織4581587.50口腔黏膜癌組織98131881.25?TRF2癌旁組織25414547.92正常口腔軟組織2145234.38

注：*與正常口腔軟組織和癌旁組織組比較，P<0.01

2.2 TRF1與TRF2在不同病理分級中的表達情況 TRF1在高分化與中分化癌組織中的陽性率均顯著高于低分化組織(P<0.05)，而TRF2高分化與中分化癌組織中的陽性率均顯著低于低分化組織(P<0.05)，表2。

表2 TRF1與TRF2在不同病理分級中的表達

注：*與低分化組比較，P<0.05

3 討論

口腔黏膜癌又稱口腔癌，是發生于口腔黏膜的鱗狀細胞癌，是常見的的惡性腫瘤之一。盡管其發病原因尚未明確，以往研究發現吸煙、飲酒，嚼檳榔等可能是主要危險因素[9]。口腔癌細胞與身體其他部位鱗癌相似，常浸潤周圍組織，有早期廣泛淋巴結轉移的傾向。WHO根據腫瘤惡性程度，將口腔鱗癌分為高、中、低分化三級[10]。

端粒是真核生物線性染色體末端的核酸蛋白復合物,在基因組完整性的保持中起主要作用,端粒功能的改變可能直接影響細胞和生物體的癌癥易感性。TRF1是端粒雙鏈DNA結合蛋白之一，具有多種重要的生物學功能。它是端粒長度的負調控因子，它能夠以二聚體的形式與端粒DNA結合，使端粒酶無法接近端粒末端發揮作用,從而縮短端粒長度[11]。研究發現，過表達TRF1能使較短端粒的細胞進入有絲分裂并誘導其凋亡[12]。TRF2是與TRF1同源的蛋白，在維持端粒長度、結構和保護染色體末端方面同樣發揮重要作用。研究表明，只有保持TRF2蛋白在一定水平，才能和其他端粒蛋白一起維持端粒結構的完整性以及基因組的穩定性[13]。在惡性腫瘤形成的早期,端粒錯誤融合,形成雙著絲粒染色體,發生斷裂融合橋循環,基因的快速重組使得極少數發生相關改變的細胞能成為癌細胞。

本研究發現,口腔癌組織中的TRF1表達水平較癌旁組織和正常組織顯著降低，而TRF2表達水平卻比癌旁組織和正常組織明顯升高。其他學者對相同部位以及身體其他部位鱗癌組織中端粒結合蛋白表達的研究結果尚未完全一致[14-16]。從TRF1和TRF2在調節端粒長度和細胞分裂的功能來看，TRF1表達水平降低意味著上皮細胞端粒酶功能的激活與增強，細胞凋亡的調節能力減弱，細胞周期延長[17]。而且本研究發現TRF1在低分化的癌旁組織表達也比中、高分化的癌旁組織表達更低，可以進一步證實對細胞癌變的影響。與TRF1表達變化正好相反，TRF2在腫瘤組織中表達水平明顯升高，但究竟是TRF2表達的異常升高影響端粒融合，還是受到基因錯誤重組的反饋調節還存在爭議。另外本研究也發現，TRF2在癌旁組織和正常組織細胞中胞核與胞漿中均有表達，而癌變細胞中卻主要集中在細胞核內，可以推測TRF2的過表達與在細胞核集中有著一定的功能上的關聯，值得進一步研究。綜上所述,TRF1、TRF2蛋白表達水平與口腔黏膜癌的發生、發展可能具有密切相關性。