REGγ基因異常表達與甲狀腺乳頭狀癌發生、發展相關性分析

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REGγ基因屬REG/11S蛋白酶體激活因子家族成員，也被稱為PSME3或PA28γ，可結合并激活20S蛋白酶體，以非泛素或非ATP依賴方式促進類固醇受體輔助活化因子-3、p21、p16等靶蛋白降解[1]。REGγ基因在結腸癌、肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤組織中高表達，或有轉移抑制作用[2-3]，但針對其在甲狀腺癌中表達的研究國內相對鮮見。本研究分別檢測REGγ基因在正常甲狀腺組織、甲狀腺良性病變組織及甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)組織中的表達情況，分析REGγ基因異常表達與PTC發生、發展的相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料 經患者知情同意，簽署知情同意書。收集2015年1月—2018年6月成都市第二人民醫院手術切除甲狀腺標本103例，經臨床病理明確診斷，其中PTC 59例，未分化癌(undifferentiated carcinoma，UTC)6例，濾泡癌(follicular carcinoma，FTC)4例，濾泡性腺瘤(follicular adenoma，FA)19例，結節性甲狀腺腫(nodular goiter，NG)15例；男性患者32例，女性患者71例；年齡20～74歲，中位年齡45歲。PTC患者腫瘤直徑<2 cm者46例，≥2 cm者13例，伴淋巴結轉移21例。距病灶2 cm處取癌旁組織14例作為正常對照。部分標本離體30 min內置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，剩余組織經10%中性福爾馬林緩沖液固定，石蠟包埋切片。

1.2 實時定量-PCR(real-time PCR，RT-PCR)法檢測REGγ mRNA表達 ①根據TRIzol試劑盒(美國Gibco-BRL公司)說明書提取總RNA，分析純度、含量，逆轉錄合成cDNA。使用Primer 5軟件設計REGγ引物，以5′-GCCTGTATCAAAGTCACCAAA-3′為上游引物，5′-CAGGAGCAGGAAAGCAAAG-3′為下游引物，產物273 bp。每份標本以β-actin為內參對照，以5′-CTCATTGCCAATGGTGST-3′為上游引物，5′-ACCGAGCGCGGCTACAGC-3′為下游引物，產物170 bp。引物均由深圳華大基因公司設計完成。同管擴增，總反應體系12.5 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s；57 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s，共32個循環；72 ℃再延伸5 min；4 ℃保存。②取10 μL PCR擴增產物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳；置紫外燈下拍照行面積灰度掃描，將密度表示其表達量；計算目的基因RT-PCR產物光密度容積與β-actin基因RT-PCR產物光密度容積的比值，將其作為目的基因mRNA的相對含量。③使用3100型全自動遺傳分析儀測定PCR產物序列，并通過Blast程序將結果與GenBank數據庫序列進行同源性比較。

1.3 免疫組化檢測REGγ蛋白表達 ①參照試劑操作說明書，使用EnVision兩步法用乙二胺四乙酸緩沖液微波抗原修復11 min。采用扁桃體作為已知陽性組織切片做陽性對照，采用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗做陰性對照。抗體及EnVision試劑盒均購自上海長嘉生物技術有限公司，DAB顯色液購自福州邁新生物技術開發有限公司。②結果判定：REGγ蛋白定位于細胞漿，呈棕黃至棕褐色染色為陽性細胞。采用網格計數法判定，隨機選取10個不重復視野，400倍光學顯微鏡下觀察免疫組化染色的陽性蛋白表達。染色強度評分：無著色計0分，淡黃色染色計1分，棕黃色染色計2分，棕褐色染色計3分。陽性細胞評分：細胞陽性率<5%計0分，細胞陽性率5%～25%計1分，細胞陽性率26%～50%計2分，細胞陽性率51%～75%計3分，細胞陽性率>75%計4分。以染色強度評分+陽性細胞評分判定染色分級，陽性為≥3分，陰性為<3分。

2 結果

2.1 總RNA鑒定 提取總RNA光密度(optical density,OD)260/280值為1.8～2.0，提示RNA提取純度較高，可滿足RT-PCR試驗要求。1%瓊脂糖電泳可觀察到2條清晰的亮帶(28 s、18 s)，提示RNA完整未降解。

2.2 RT-PCR檢測 β-actin內參基因片段長度170 bp，REGγ目的基因片段長度273 bp(圖1)；PTC組織中REGγ mRNA表達水平顯著高于FA、NG及癌旁正常甲狀腺組織，差異比較具有統計學意義(t分別為6.503，4.119，5.520，P<0.05)；PTC組織中REGγ mRNA表達水平與UTC、FTC組織比較，差異比較無統計學意義(t分別為0.630，0.352，P>0.05)；不同年齡、性別患者REGγ mRNA表達水平比較，差異比較無統計學意義(P>0.05)；腫瘤直徑<2 cm患者REGγ mRNA表達水平顯著高于腫瘤直徑≥2 cm患者，無淋巴結轉移患者REGγ mRNA表達水平顯著高于淋巴結轉移患者，差異比較有統計學意義(P<0.05，表1)。

1：陰性對照；2：癌旁正常甲狀腺組織；3，4：FA；5，6：PTC；M：DNA標記圖1 RT-PCR法檢測REGγ mRNA表達

參數nREGγ mRNAREGγ蛋白陽性[n(%)]組織類型 PTC593.58±1.6039(66.10) UTC63.16±0.922(33.33) FTC43.29±1.482(50.00) FA191.07±0.894(21.05) NG151.84±0.610(0.00)癌旁正常甲狀腺組織141.18±0.510(0.00)臨床病理特征 年齡(歲)<45413.70±1.5629(70.73)≥45183.35±1.4410(55.56) 性別男性173.73±1.048(47.06)女性423.59±1.5128(66.67) 腫瘤直徑(cm)<2464.05±0.9537(80.43)≥2132.99±0.484(30.77) 淋巴結轉移有212.94±1.299(42.86)無384.22±1.4334(89.47)

2.3 免疫組化 REGγ蛋白在癌旁正常甲狀腺組織中少量表達，主要表達在濾泡上皮細胞的胞漿；癌組織內可見腫瘤細胞胞漿陽性著色；不同PTC病例呈不同程度異常表達(圖2)。PTC組織中REGγ蛋白陽性率為66.10%，高于UTC(33.33%)及FTC(50.00%)，但組間比較差異比較無統計學意義(χ2=2.511，0.427，P>0.05)；FA組織中REGγ蛋白陽性率為21.05%，NG及癌旁正常甲狀腺組織REGγ蛋白均為陰性表達，與PTC組織比較差異具有統計學意義(χ2=11.791，20.964，19.869，P<0.05)；不同年齡、性別患者REGγ蛋白陽性率比較，差異比較無統計學意義(P>0.05)；腫瘤直徑<2 cm患者REGγ蛋白陽性率顯著高于腫瘤直徑≥2 cm患者，無淋巴結轉移患者REGγ蛋白陽性率顯著高于淋巴結轉移患者，差異比較具有統計學意義(P<0.05)(表1)。

A：PTC患者REGγ蛋白陽性表達；B：PTC患者REGγ蛋白陰性表達；C：癌旁正常甲狀腺組織REGγ蛋白陰性表達圖2 PTC患者REGγ蛋白表達(EnVision×200)

2.4 REGγ mRNA與蛋白表達的關系 Spearman相關性分析顯示，PTC組織中REGγ mRNA與蛋白表達呈正相關關系(r=0.504，P<0.05)(圖3)。

圖3 REGγ mRNA與蛋白表達的相關性

3 討論

隨著人們生活方式的改變，癌癥已上升至人類全部死因的第二位，肺癌、大腸癌、肝癌等惡性腫瘤已成為威脅患者生命的主要疾病[4-5]。目前，對于這些疾病尚無十分有效的治療手段，因此急需了解其發病機制，尋找新的藥物靶點，開發新型藥物。REGγ是一種蛋白酶體激活因子，在細胞周期和腫瘤發生、發展的調控中起重要作用。目前研究發現REGγ基因在結腸癌、肝癌、肺癌中均有過表達，且與腫瘤的發生、發展密切相關[6]。然而，對REGγ基因在PTC中的表達水平以及表達調控機制尚不清楚。

REGγ-蛋白酶體屬REG/11S家族蛋白酶體激活因子，可結合并激活20S蛋白酶體，與19S激活因子-蛋白酶體以泛素和ATP依賴的經典方式降解蛋白底物[7-8]。而REGγ-蛋白酶體降解蛋白質底物卻并不需底物泛素化或ATP[9]。REGγ最初是在系統性紅斑狼瘡患者血清中發現，其蛋白降解功能一直受到臨床關注，并形成了經典的觀點，認為REGγ僅降解短肽片段，不能降解胞內完整的蛋白[10-11]。但近年來Li等[12]研究推翻了這一觀點，其研究認為REGγ-蛋白酶體可降解與體內多種腫瘤形成密切相關的類固醇受體輔助活化因子-3(SRC-3)。隨后Mao等[13]研究者相繼發現若干REGγ重要靶點(p53、p21、p16、p19)，進一步證實了REGγ的生物功能多樣性和重要性。Barton等[14]最近研究發現，REGγ缺陷小鼠因特異有絲分裂缺陷而體型消瘦，在果蠅內發現REGγ對細胞分裂的效應[15]，由此認為REGγ是細胞周期進程和細胞生存的重要調節因子，是致癌潛力的重要調節機制，對腫瘤的發生、發展起重要作用。本研究調查PTC病理組織中REG的表達，獲得REG在癌旁正常組織及腫瘤組織中的差異性表達信息，了解REG與PTC發生、發展的關系，揭示REG異常表達的調控機制，結果顯示PTC組織中REGγ mRNA表達水平為(3.58±1.60)，顯著高于FA、NG及癌旁正常甲狀腺組織，提示REGγ在PTC中表達上調。

免疫組化結果顯示REGγ蛋白在FA中的表達介于PTC與正常甲狀腺組織之間的過渡性改變；PTC組織REGγ蛋白表達陽性的病例癌旁正常甲狀腺組織REGγ蛋白均為陰性。進一步行Spearman相關性分析發現PTC組織中REGγ mRNA與蛋白表達呈正相關關系。以上結果提示REGγ基因表達與PTC發生、發展相關，其表達水平上調可能是PTC病情進展的早期表現。

綜上所述，REGγ基因表達可能與PTC發生、發展密切相關，或可將REGγ表達水平上調作為評價腫瘤惡性程度、轉移情況及預后評估的參考指標；PTC患者REGγ mRNA表達與REGγ蛋白水平的總體趨勢一致，可認為REGγ蛋白增加多依賴mRNA合成增加，但REGγ基因表達異常可能涉及基因轉錄等多個層面，其具體機制還有待進一步研究探討。