長鏈非編碼RNA腫瘤抑制因子對阿霉素誘導的A549細胞凋亡的影響

， ， ，翠云，，

癌癥是當今人類面臨的巨大問題之一，肺癌的發病率和死亡率均位居全部惡性腫瘤之首，并且肺癌的發病率逐年上升，肺癌的發病因素很多，主要包括環境污染、吸煙、作息不規律以及酗酒等。由于肺癌的早期臨床表現不典型，在一定程度上限制其早期發現與治療，肺癌的中晚期治療以化療為主[1-4]。阿霉素(doxorubicin，DOX)是臨床上被廣泛應用于治療多種惡性腫瘤的化療藥物，但是腫瘤的耐藥性影響了其應用[5]。因此探究某些分子在DOX誘導腫瘤細胞凋亡過程中的作用與機制，將為肺癌的治療提供新的途徑。

線粒體是能量代謝中心，線粒體含有很多的膜蛋白，如線粒體融合蛋白1和線粒體融合蛋白2、視神經蛋白1；線粒體分裂蛋白，如動力相關蛋白1、金屬肽酶OMA1、線粒體分裂蛋白1[6-7]，這些膜蛋白參與線粒體的分裂與融合的過程。有文獻報道，線粒體的分裂是細胞凋亡的早期過程，線粒體在介導細胞凋亡過程中發揮重要作用[8]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類轉錄本長度超過200 nt且缺乏蛋白質編碼功能的RNA，能夠在表觀遺傳水平、轉錄水平和轉錄后水平調控基因的表達，廣泛參與機體的生理和病理過程[9]。相關研究報道，肺腺癌轉移相關轉錄子1[10]、HOX基因的反義基因間RNA[11]、lncRNA SOX2重疊轉錄本[12]在非小細胞肺癌中高表達，能夠促進肺癌細胞的侵襲與遷移，可以作為肺癌早期診斷的生物標志分子。越來越多的研究發現lncRNAs作為原癌基因或者抑癌基因參與腫瘤的發生過程以及lncRNAs在腫瘤治療中存在著重要的作用[13-14]。

本研究擬通過研究lncRNA對DOX誘導的肺癌細胞系A549細胞凋亡的影響，進一步了解其作用機制，尋找預防和治療肺癌的新靶點，為肺癌治療提供新的視野與理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人源肺癌細胞系A549細胞(上海中國科學院細胞庫)；293T細胞(上海中國科學院細胞庫)；肺癌組織和癌旁組織樣本(山東青島大學附屬醫院)；DMEM培養基和胎牛血清(美國Gibco公司)；DOX(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；嘌呤霉素(美國Invotrogen公司)；TRIzol(美國Thermo Fisher Scientific公司)；RNA反轉錄試劑盒和Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR試劑盒以及SYBR Premix EX TaqTMⅡ(日本TaKaRa公司)；MitoTracker線粒體染色試劑(美國Molecular Probes公司)；細胞凋亡檢測試劑盒(碘化丙啶、異硫氰酸熒光素雙染法)(上海七海復泰生物科技有限公司)。

1.2 基因芯片 將A549細胞分為2組，一組加2 μmol/L的DOX進行處理，另一組作為對照不做處理，24 h后提取細胞的總RNA，送上海歐易生物醫學科技有限公司做lncRNAs基因芯片分析。根據生物公司的芯片分析結果，挑選了差異倍數大且P值小的lncRNAs在細胞水平通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技術進行復篩，最終篩選出差異顯著，表達穩定的lncRNA，lnc-ZMYM6-2-1,我們命名為lncRNA腫瘤抑制因子(tumor inhibitory factor，TIF)。

1.3 qRT-PCR 采用Trizol法提取細胞和組織樣本的總RNA，使用NanoDrop 2000檢測RNA的純度與濃度，分別取1 μg RNA作為模板，使用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，通過qRT-PCR檢測lncRNA TIF的表達。LncRNA TIF上游引物序列為：TAAACATACGTGTGCATGTGTCT，下游引物序列為：TCAGTGTGGCGATTCCTCAG；GAPDH作為內參基因，其上游引物序列為：GTCGGAGTCAACGGATTTG,下游引物序列為：TGGGTGGAATCATATTGGAA。

1.4 載體的構建 通過青島擎科生物技術有限公司合成lncRNA TIF的shRNA引物，將引物稀釋后在PCR儀內進行退火；將pLKO.1-puro載體通過AgeI和EcoRI進行雙酶切，酶切后的pLKO.1-puro和退火后的shRNA片段通過T4連接酶進行連接并轉化DH5α涂布氨芐抗性平板，挑取陽性克隆進行測序，將測序結果正確的克隆提取質粒備用。

1.5 慢病毒細胞系的構建 將慢病毒表達質粒pLKO.1-TIF-shRNA與空載體pLKO.1-puro分別和慢病毒包裝質粒(PMD2.G和PSPAX2)通過磷酸鈣方法轉染到293T細胞中，12 h后，換成無青、鏈霉素雙抗的培養基繼續培養24 h后，收集病毒液，用0.45 μm針頭式濾器過濾后感染A549細胞，48 h后添加嘌呤霉素篩選感染成功的細胞。

1.6 MitoTracker 線粒體染色 在24孔板內放置滅菌的0.5×0.5蓋玻片，用1%的多聚賴氨酸在37 ℃培養箱中處理1 h，PBS洗滌2遍，接種細胞并進行培養與處理后，用0.02 μmol/L的MitoTracker染色20 min，PBS洗滌2遍，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌3遍，將細胞面扣在含有DAPI封片劑的載玻片上，通過雙光子激光共聚焦顯微鏡拍片并計算發生線粒體分裂的細胞所占比值。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將細胞用無EDTA的胰酶消化并制備細胞懸液，在4 ℃離心機內以900 r/min的轉速離心10 min，去上清，加入預冷的PBS在4 ℃離心機內以900 r/min的轉速離心10 min，去上清，重復洗滌3次。然后按照凋亡試劑盒說明書進行操作，通過流式細胞儀進行檢測。

2 結果

2.1 LncRNAs基因芯片結果和目的lncRNA TIF的確定 基因芯片結果顯示2 μmol/L DOX處理組與對照組比較，含有差異表達的lncRNAs 3 036個，其中包括1 115個上調的lncRNAs，1 921個下調的lncRNAs。挑選出18個差異倍數大的lncRNAs通過qRT-PCR進行復篩，最終確定了差異顯著且穩定表達的目的lncRNA TIF，qRT-PCR結果顯示DOX處理后lncRNA TIF的表達明顯高于對照組(n=3；t=6.4，P<0.01，圖1)。

注：與對照組比較，**P<0.01；n=3；t=6.4；A：DOX處理24 h后，基因芯片初步篩選出差異表達的lncRNAs；B: qRT-PCR檢測DOX處理24 h后， DOX處理組與對照組中lncRNA TIF的表達情況圖1 lncRNAs基因芯片結果和目的lncRNA TIF的確定

2.2 肺癌組織中lncRNA TIF的表達 通過qRT-PCR檢測19例肺癌患者臨床組織樣本肺癌組織和癌旁組織中lncRNA TIF的表達情況，結果顯示肺癌組織中lncRNA TIF的表達量低于癌旁組織，差異比較具有統計學意義(n=19；t=18.5，P<0.01，圖2)。

注：與癌旁組織組比較，**P<0.01；n=19；t=18.5圖2 肺癌組織與癌旁組織中lncRNA TIF的qRT-PCR檢測結果

2.3 LncRNA TIF沉默細胞系的鑒定 通過qRT-PCR檢測沉默細胞系(shlncRNA TIF)與沉默對照細胞系(shCtrl)中lncRNA TIF的表達，結果顯示shlncRNA TIF沉默細胞系中lncRNA TIF的表達量明顯低于沉默對照細胞系，差異比較具有統計學意義(n=3；t=11.18，P<0.001，圖3)。

注：與沉默對照組比較，***P<0.001；n=3；t=11.18圖3 shlncRNA TIF沉默細胞系與沉默對照細胞系中lncRNA TIF的表達

2.4 沉默lncRNA TIF抑制DOX誘導的線粒體分裂 通過DOX處理24 h后，線粒體斷裂呈現點狀，當沉默A549細胞中的lncRNA TIF后，線粒體分裂數顯著降低，差異比較具有統計學意義(n=3；t=21.69，P<0.01)，沉默A549細胞中lncRNA TIF的表達能夠抑制DOX誘導的線粒體分裂，在A549細胞中lncRNA TIF具有促進線粒體分裂的功能，圖4。

注：與沉默對照組比較，**P<0.01；n=3；t=21.69；A: 線粒體分裂(點狀分布)與融合狀態(網狀分布)的形態。紅色：MitoTracker染色的線粒體；藍色：DAPI染色的細胞核。標尺：10 μm。B: 線粒體分裂情況的量化。圖4 各組線粒體分裂情況比較

2.5 沉默lncRNA TIF抑制DOX誘導的細胞凋亡 通過DOX處理24 h后，A549細胞明顯發生凋亡，當沉默A549細胞中的lncRNA TIF后，細胞凋亡顯著降低，差異比較具有統計學意義(n=3；t=8.75，P<0.05，圖5)，在A549細胞中lncRNA TIF具有促進細胞凋亡的功能。

圖5 各組細胞凋亡情況比較

3 討論

肺癌具有高發病率和高死亡率的特點，其中非小細胞肺癌所占比例高達85%[15]。化療是肺癌治療的一種策略，DOX在臨床上作為廣譜的腫瘤化療藥物，通過誘導腫瘤凋亡、自噬、壞死發揮抗腫瘤的作用，但是腫瘤的耐藥性在一定程度上限制了DOX的應用[16]。

近年來，對于肺癌的早期診斷以及治療取得了進展，但是結果還是不容樂觀[17]，伴隨著生物信息學的快速發展，發現lncRNA與肺癌的發生和發展有著密切關系，探究其機制具有重大意義[18]。采用基因芯片技術以及RNA序列分析技術對肺癌組織和癌旁組織進行分析，發現上千個lncRNAs與肺癌的發生相關[19]。研究發現CARLo-5是與肺癌發生相關的lncRNA，在肺癌組織中高表達，通過RNA干擾技術沉默其表達能夠抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲[20]。P27是腫瘤抑制因子，LUADT1在表觀遺傳水平通過抑制其表達促進肺腺癌細胞的增殖[21]。P53作為一個重要的腫瘤抑制因子，H19通過抑制P53的表達發揮致瘤因子的功能，而MEG3能夠通過多種機制促進P53的表達發揮抑制腫瘤的功能[22]。LncRNA TP73-AS1作為內源競爭RNA,通過靶向miR-449a的3′非翻譯區發揮原癌基因的功能，敲低lncRNA TP73-AS1能抑制腫瘤的發生[23]。

本研究采用基因芯片技術，篩選到DOX處理后差異表達的lncRNAs，通過qRT-PCR復篩得到差異最顯著的lncRNA，lncRNA TIF。結果顯示DOX處理后能夠誘導lncRNA TIF的表達，進一步通過檢測臨床肺癌組織樣本，發現lncRNA TIF在肺癌組織中低表達。因此說明lncRNA TIF可能作為一種抗腫瘤的lncRNA。而lncRNA TIF又是如何發揮抗腫瘤的呢？作者在細胞水平上通過MitoTracker線粒體染色和流式細胞儀檢測了lncRNA TIF在DOX誘導的線粒體分裂和細胞凋亡中的作用，發現DOX能夠誘導線粒體分裂和細胞凋亡，而敲低lncRNA TIF能夠抑制DOX誘導的線粒體分裂和細胞凋亡。

綜上所述，化療藥物DOX能夠誘導lncRNA TIF的表達進而誘導細胞凋亡，lncRNA TIF可能通過促進線粒體分裂來促進細胞凋亡，線粒體中含有大量的膜蛋白，lncRNA TIF可能通過與線粒體膜蛋白相互作用從而促進細胞凋亡，而這一過程的具體機制還有待于進一步研究。這一發現為肺癌的治療提供了新的視野，lncRNA TIF有希望成為肺癌治療的新靶點。