反相紙層析法分離油菜籽中脂肪酸的經驗總結

李海霞， 王 晶， 何 瑩， 曾漢來， 王學奎， 豐勝求

(華中農業大學 植物科學技術學院 作物學國家級實驗教學示范中心， 武漢 430070)

脂肪酸是由碳、氫及氧3種元素組成的一類化合物，是中性脂肪、磷脂和糖脂的主要成分，為有機體主要能量來源之一。對脂肪酸進行分離與分析的方法有多種[1-4]，目前科研上使用較多的方法主要包括氣相色譜法[5-7]、近紅外光譜技術法[8-9]、氣相色譜-質譜聯用法[10-12]等。這些方法的優點是靈敏度高、檢出限低、分辨率高和重復性佳，能夠對脂肪酸進行準確、快速和全面的檢測。但這些方法使用的都是大型精密儀器，價格昂貴，不適宜引入本科實驗教學。

在華中農業大學本科生的基礎生物化學實驗課程中開設了利用反相紙層析法分離油菜籽中主要不飽和脂肪酸的實驗內容。利用反相紙層析法分離和測定混合高級脂肪酸的含量是一種較成熟的方法。原理是由于脂肪酸在固定相和移動相中的分配系數不同，其在層析濾紙上移動速率就有差異，所以層析完成后就能使混合脂肪酸各組分分開，然后用醋酸銅處理，將脂肪酸轉化成脂肪酸銅鹽，再用紅氨酸顯色，就可以得到藍灰色的點狀層析圖譜[13]。雖然反相紙層析法不能定量分析脂肪酸，但該法快速、簡便，結果可視性強，有利于學生對脂肪酸基本理論知識的理解，比較適合于人數較多又有一定學時限制的本科實驗教學。

按照實驗操作步驟[13]，樣品經過制備(皂化和酯化)、點樣、展開和顯色后，理想的結果是在層析紙上出現比較清晰的3～5個相互分離的藍灰色斑點(圖1)。然而在實驗教學中由于受到多種因素的影響，經常會出現各種各樣的問題，尤其是脂肪酸層析圖譜分不開的問題——拖尾現象(圖1-D)，即各斑點之間界線不明，或者根本沒有界線，導致老師及學生具有一定的失敗感。經過多年大量的實驗摸索，不斷優化實驗條件，使反相紙層析法在實驗教學中取得了較滿意的結果。現將經驗進行如下總結。

A：高芥酸油菜；B：低芥酸油菜；C：層析圖譜傾斜；D：拖尾現象。1：亞麻酸；2：亞油酸；3：油酸；4：二十碳烯酸；5：芥酸

圖1油菜籽中主要不飽和脂肪酸反相紙層析圖譜

Figure 1 Reversed-phase paper chromatogram of main unsaturated fatty acids from rapeseed

1 層析紙制作

先將新華1號層析濾紙裁成15 cm×15 cm大小，然后將一定濃度的液體石蠟-石油醚溶液倒入瓷盤內，再將裁好的濾紙在溶液中拖過，浸透后立即取出，晾干即可。雖然處理好的濾紙可以存放，但不宜超過兩個星期。

在層析紙制作時應注意，每次只能處理1～2張濾紙，且濾紙在液體石蠟-石油醚溶液中的操作要快，一定不能浸泡，由于石油醚具有揮發性，這樣操作會使濾紙上的液體石蠟的濃度不均一，而導致同一批次處理的層析紙層析效果不穩定而變差。

通過6%、8%、10% 等不同體積濃度的液體石蠟-石油醚溶液(如配制100 mL 6%液體石蠟-石油醚溶液配方是：6 mL液體石蠟+ 94 mL石油醚)處理濾紙的對比實驗，發現6%濃度處理的濾紙雖然層析速度較快，但層析效果不是很好，10%濃度雖然層析效果不錯，但層析速度較慢，綜合起來8%濃度層析效果最佳，層析時長為1.5～2 h，適合實驗教學學時安排。因而在實驗準備中選擇用8%濃度的液體石蠟-石油醚溶液處理濾紙。

文獻[14]報道用沸點60℃～90℃的石油醚代替30℃～60℃ 的石油醚處理層析紙更經濟。我們通過實驗發現，用60℃～90℃ 的石油醚配制的500 mL 8%液體石蠟-石油醚溶液可以制作80～90張層析紙，而用30℃～60℃ 的石油醚配制的僅可以制作50～60張。此外，用60℃～90℃的石油醚處理的層析紙層析效果較穩定，因為它的揮發速度比30℃～60℃ 的石油醚慢，使層析紙上的石蠟分布比較均勻。因此，在處理層析紙時采用沸點60℃～90℃代替30℃～60℃的石油醚。

2 樣品制備

2.1 樣品皂化和酯化

干燥的油菜籽磨碎后，以8∶1(V/W)的比例加入5%KOH溶液，放置2～3 d，使樣品充分皂化和酯化，用以提取脂肪并使其轉化為脂肪酸甲酯。使樣品皂化和酯化的試劑配方一般用5% KOH 甲醇溶液。因為95%乙醇比甲醇毒性小，經過實驗，用5 g KOH+100 mL 95% 乙醇效果也不錯，因此我們選擇了用95%乙醇配制的5% KOH溶液。另外，酯化好的樣品溶液經實驗證明室溫下可長期保存。

2.2 點樣液制備

在酯化好的樣品溶液中，先以2∶1(V/V)的比例加入1 mol/L鹽酸，使脂肪酸甲酯轉化為各種游離的脂肪酸，再以1∶1(V/V)的比例加入石油醚用于萃取脂肪酸，混勻，靜置，上層即為點樣液。若加入的鹽酸量不足，不能使脂肪酸甲酯充分轉化為脂肪酸[14]，就會導致脂肪酸層析圖譜不能完全分開，可通過加入梯度量的鹽酸找到最適合的鹽酸用量。

點樣液的濃度可通過加入不同量的石油醚來調整。若后續要定量點樣，萃取時應加入60℃～90℃的石油醚，因為30℃～60℃的石油醚揮發較快，用移液器吸取微量點樣液后還來不及點樣就會揮發完。

3 點樣

在處理好的層析紙一端用鉛筆輕輕畫一直線，每間隔一定距離用鉛筆點一記號，在記號處用針刺一小孔(一定要與紙垂直穿透)，然后用移液器吸取點樣液 5 μL(通過實驗確定的最佳點樣體積)，分2～3次點入孔洞處，斑點應小而圓，直徑不能超過0.3 cm。

點樣技術也直接影響脂肪酸層析圖譜質量的優劣，以下3點一定要注意：1)用移液器吸取點樣液后應盡快點樣，不要耽擱時間太長，否則會出現沒有層析斑點或斑點太淡的現象；2)點樣液分2～3次點入孔洞時，斑點應小而圓，而且要等前一次的點樣液干燥后再點入下一次，否則易出現拖尾現象；3)點樣時，槍頭每次都要對準孔洞，且槍頭與層析紙一定要垂直，否則也易出現拖尾現象。

4 展開溶劑系統與條件

將點好樣的層析紙點樣面朝內卷成筒狀，用訂書機固定兩端，使編號端朝下放入盛有95%醋酸溶液(展層劑)的層析缸中，并立即蓋好層析缸蓋子開始層析(注意檢查密閉性)。當展層劑前沿上升到距濾紙頂端1～2 cm處時停止層析，取出層析紙，用吹風機吹干層析紙。

將點好樣的層析紙卷成筒狀并用訂書機固定時兩側不能重疊，需留有一點縫隙，否則層析圖譜會出現傾斜情況。95%醋酸溶液的多少以能夠浸泡層析紙但液面低于點樣處為宜，過少會使層析時間延長，過多會使液面高于點樣處而使脂肪酸樣品溶解在展層劑中而不能層析。此外，因為醋酸易揮發，用95%醋酸溶液做展層劑連續使用幾次后濃度降低，使層析速度變慢，且圖譜也易出現拖尾現象。因而針對同一個層析缸，在層析2～3次后一定要更換新的95%醋酸溶液才不會影響層析效果。

5 顯色

通過實驗，我們將文獻[13]中的1%醋酸銅溶液改成0.1%的濃度，顯色后非但沒有影響層析斑點的顏色，層析紙背景的顏色還變淡了，層析效果變優，同時又節約了試劑用量。

顯色過程為將吹干的層析紙放入0.1%醋酸銅溶液中浸泡15～20 s，使脂肪酸生成脂肪酸銅鹽。先用清水沖洗，再放入潔凈的瓷盤中，用流水漂洗30 min以上。然后將層析紙小心取出，放置在潔凈的吸水紙上，用電吹風吹干。再將吹干的層析紙在0.03%紅氨酸溶液中一帶而過，即可在層析紙上顯出藍灰色的斑點。高芥酸油菜有5個斑點(圖1-A)，從上往下分別是亞麻酸、亞油酸、油酸、二十碳烯酸和芥酸，低芥酸油菜有3 ～ 5 個斑點，3個斑點時沒有芥酸和二十碳烯酸(圖1-B)，4個斑點時沒有芥酸。

實驗時脂肪酸層析圖譜容易出現的問題除了拖尾現象，還有背景顏色過深、層析圖譜傾斜(圖1-C)等，對此進行了常見問題解析(表1)，在實驗教學中能針對性解決脂肪酸層析中出現的問題。

表1 反相紙層析法分離油菜籽中主要不飽和脂肪酸常見問題解析

隨著信息技術的發展，開展示范性虛擬仿真實驗教學項目建設，是提升實驗教學質量和水平的重要舉措[15]。后續我們將進行采用氣相色譜-質譜聯用儀對多種脂肪酸進行測定的虛擬仿真實驗教學項目的建設，以此實現在“主要不飽和脂肪酸的分離”實驗教學中采取虛實結合的方法進一步提高基礎生物化學實驗教學的質量。