三甲胺表征縊蟶貯藏過程中新鮮度變化的研究

冉 云， 張思嘉， 冉照收， 徐繼林， 廖 凱

(寧波大學 海洋學院， 寧波 315211)

縊蟶(Sinonovaculaconstricta)是常見的海鮮食材，營養物質豐富，蛋白質占干重的50%以上，具有豐富的不飽和脂肪酸，特別富含淡水貝類缺乏的DHA、EPA等人體生長必需的營養物質[1-2]，已成為東南沿海的主要海水貝類養殖品種。縊蟶通常是在鮮活狀態下食用，經蒸煮可產生麥芽酚、DMHF雜環類等物質使之具有清甜、焦香味[3]。但在死亡狀態下，由于內外源蛋白酶的分解、細菌繁殖以及生化反應的發生，蟶肉組織會迅速發臭，以致不能食用[4]。其中三甲胺作為腐敗氣味關鍵性成分，在腐敗的海產品中極為常見，目前三甲胺已經作為多種水產品新鮮度的判定參數[5-10]。因此，本文通過測定縊蟶在-20℃、4℃、26℃貯藏條件下的三甲胺(trimethylamine，TMA)含量變化，為縊蟶貯藏過程中的保鮮提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

在寧波寧海新捕撈的帶泥縊蟶加冰運回實驗室，從中挑選長(7.11±0.18)cm，寬(2.37±0.05)cm的縊蟶，避光置于鹽度25 PSU(Practical salinity units，實用鹽標)的海水中暫養2 h后，隨機選取一部分縊蟶放入保鮮袋中于-20℃凍藏；剩余縊蟶分為兩部分，依然置于海水中，溫度分別為4℃和26℃。

1.2 儀器與試劑

7890B-7000C氣相色譜-三重四級桿質譜聯用儀 (美國安捷倫儀器公司)；頂空進樣系統 (德國Gerstel公司)；VOCOL色譜柱(60 m×0.32 mm，0.18 μm, 美國Supelco公司)；分散機(T10基本型，不銹鋼材質，鋸齒形分散刀具，德國IKA公司)。

標準三甲胺鹽酸鹽(純度≥98%，國藥集團化學試劑有限公司)；氫氧化鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；三氯乙酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

標準溶液配制：稱取三甲胺鹽酸鹽標準品0.0810 g，溶解在5%的三氯乙酸溶液中，定容至500 mL，相當于濃度100 μg/mL的三甲胺標準儲備液，然后用5%的三氯乙酸溶液逐級稀釋成濃度分別為2.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05和0.02 μg/mL的三甲胺標準使用溶液。

樣品制備：參照國標GB5009.179—2016《食品中三甲胺的測定》，將3種貯藏溫度下的縊蟶分別取樣(-20℃的樣品先解凍)，去殼后在自然狀態下吸干多余水分，稱取約5 g(精確至0.001 g)樣品于50 mL的塑料離心管中，然后加入10 mL的5%三氯乙酸溶液，用分散機將其混合均勻后，以4000 r/min離心5 min，在玻璃漏斗上用三層濾紙將上清液濾入25 mL容量瓶，殘留物再分別用8 mL和5 mL 5%三氯乙酸溶液重復上述提取過程2次，合并濾液并用5%三氯乙酸溶液定容至25 mL進行頂空氣相色譜-質譜聯用分析，每組3個平行。

1.3.2 頂空進樣條件

標準溶液頂空處理：分別取各濃度標準溶液2.0 mL于20 mL頂空瓶中，擰緊瓶蓋，用醫用塑料注射器準確注入5.0 mL 50%氫氧化鈉溶液，上機檢測。

三甲胺提取液頂空處理：準確吸取2.0 mL提取液于20 mL頂空瓶中，擰緊瓶蓋，用醫用塑料注射器準確注入5.0 mL 50%氫氧化鈉溶液，上機檢測。

頂空進樣：將制備好的試樣在40℃平衡40 min，然后用Gerstel 2.5 mL自動進樣針抽取頂空瓶內液面上方的氣體250 μL，注入氣相色譜(GC)-質譜(MS)聯用分析系統中進行測定。

1.3.3 GC-MS檢測條件

GC條件：VOCOL色譜柱(60 m×0.32 mm×0.18 μm)；載氣為高純氦氣，流量1.6 mL/min。升溫程序：柱起始溫度40℃，保持3 min，以30℃/min升至200℃，保持1 min；采用分流進樣模式，分流比為25∶1。

MS條件：電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230℃。掃描方式為選擇離子掃描(SIM)，所選離子質荷比分別為42、58和59。

1.3.4 數據的處理與分析

定性測定：以樣品溶液中三甲胺的保留時間(RT)、定量離子(m/z 58)、輔助定性離子(m/z 59和m/z 42)定性，并以試樣溶液中三甲胺的輔助定性離子和定量離子峰度比(Q樣品)與標準溶液中三甲胺的輔助定性離子和定量離子峰度比(Q標準)進行比較(相對偏差控制在±15%以內)輔助定性。

定量測定：用外標法定量。縱坐標為標準溶液中三甲胺的峰面積，橫坐標為標準溶液中三甲胺的濃度，以此繪制校準曲線計算試樣溶液中三甲胺的濃度。

2 結果與分析

新起捕的帶泥縊蟶兩片貝殼閉合緊密，足部和水管伸縮靈活，肌肉白嫩堅實，手感爽滑、極富彈性。常溫26℃下在海水中靜養1 d之后，縊蟶活躍度有所下降，2 d后則已死亡，貝殼關閉不緊甚至有的已經張開，足和水管失去伸縮能力，肉質灰暗比較松散，手感黏滯、彈性很差并散發出腥臭味。4℃下縊蟶在海水中靜養，從第1天到第4天，除了活動能力減弱，其他未見明顯變化；但到第8天時，已徹底失去活動能力，肌肉仍有彈性，無異味，對外界刺激無任何反應。-20℃凍藏縊蟶，從第1天到第30天，未發生明顯感官變化。從上述縊蟶的感官變化可以發現，在常溫26℃和4℃冷藏條件下，隨著時間的增長，縊蟶的生命力在逐漸下降，為了更客觀、靈敏地表述這種變化，本研究采用檢測三甲胺含量來表征縊蟶貯藏過程中的新鮮度。

三甲胺有魚腥惡臭，是一種污染物質，對人的眼、鼻、咽喉和呼吸道有刺激作用，常用作評價魚類新鮮度的一個指標，最早發現是由微生物分解甜菜堿、膽堿和氧化三甲胺而來[11]。有研究認為：新鮮活體中三甲胺以氧化物的形式存在，用于維持肌肉細胞正常生理功能，當生物體死亡后，體內的還原酶將三甲胺氧化物分解為三甲胺，從而釋放出刺鼻氣味；另外，生物體內的卵磷脂在微生物作用下也會分解產生三甲胺[12]。本實驗測定了常溫26℃、4℃冷藏以及-20℃凍藏條件下三甲胺含量隨貯藏時間的變化(表1)。

表1 不同貯藏條件下縊蟶中三甲胺含量變化

結果表明，新采捕的帶泥縊蟶，在自然凈化2 h后第一次取樣檢測三甲胺濃度最低(0.322 mg/kg)。隨著時間的增長，3組置于不同溫度下的縊蟶三甲胺含量都呈上升趨勢：常溫26℃條件下從2 h到24 h，三甲胺含量增加較慢，而從24 h到48 h則急劇增多，48 h時死亡腥臭的縊蟶檢測到的三甲胺含量已高達13.954 mg/kg；4℃下養在海水中的縊蟶到第4天時仍然存活，三甲胺含量雖有所上升但增速較緩，第8天時縊蟶已失去生命活力，此時測得的三甲胺含量已經上升到1.369 mg/kg；而在-20℃下貯藏的縊蟶，三甲胺含量上升趨勢比較緩慢，貯藏30 d時濃度僅為0.564 mg/kg。

可用于評價水產品貯藏過程中鮮度的指標有揮發性鹽基氮(TVB-N)、三甲胺(TMA)、菌落總數(TVC)、產硫化氫細菌及假單胞菌數等，在用三甲胺表征水產品新鮮度或腐敗情況時，有研究提出100 mg/kg為魚類三甲胺含量的上限[13]，當然有些生物品種的限量會低于此標準，比如小黃魚三甲胺含量超過35 mg/kg時，魚肉就開始腐敗變質[14]，這可能與生物體生長環境及菌群差異有關[15-17]。但這些數值顯然不適用于縊蟶。由表1可見，4℃下縊蟶完全失去活動能力時三甲胺的濃度也只有(1.369±0.008) mg/kg，所以對于縊蟶而言，用三甲胺表征新鮮度時其濃度值以小于1.3 mg/kg為宜。縊蟶三甲胺上限遠低于魚類的原因，可能跟貝類蛋白質組成跟魚類有著明顯的差異[18-19]以及共生菌群存在差異有關[20-21]。

隨著貯藏時間的加長，縊蟶在微生物的作用下，蛋白質、氨基酸和體內其他含氮物質被逐漸分解，產生三甲胺、氨、組胺、硫化氫和吲哚等產物，這是造成縊蟶腐敗變質繼而散發出腥臭味的主要原因。這些微生物多為腐敗細菌，主要來自水中，有假單胞菌屬、小球菌屬、產硫化氫菌屬等[22]。而低溫條件不利于此類細菌的生長，表1也表明縊蟶中三甲胺的增長明顯受到低溫的抑制，可見低溫有利于維持縊蟶的新鮮度。

3 結論

本研究為縊蟶貯藏過程中新鮮度的變化提供了理論參考。三甲胺的總量隨貯藏時間加長而不斷增加，常溫26℃條件下增長較快，隨著縊蟶死亡而急劇增加，帶有刺鼻的腥臭味，細菌腐敗是造成縊蟶變質發臭的主要原因；4℃低溫冷藏情況下三甲胺含量增加緩慢，低溫抑制了腐敗微生物的生長繁殖；-20℃低溫凍藏在30 d時，三甲胺含量依然很低，相對來說縊蟶依然處于比較新鮮的狀態。