血清微RNA-21和磷酸脂酶-張力蛋白同源物在糖尿病心肌病患者中的表達及其臨床意義

唐 艷 鄧蘇辛

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是一類發生于糖尿病患者，以心力衰竭為主要臨床表現，不能用高血壓性心臟病、冠狀動脈性心臟病(簡稱冠心病)，以及其他心臟病變來解釋的心肌疾病。其發病機制復雜，目前未被完全了解。微RNA(miRNA)為一種小分子非編碼RNA，通過與靶基因mRNA分子的3’-非編碼區(3’-UTR)配對并與之結合，從而降解靶mRNA，抑制翻譯，參與多種心血管疾病的病理生理過程[1]。近來研究表明，miRNA與DCM有一定的相關性，未來可能成為DCM的治療新靶向。在眾多miRNA中， miRNA-21(miR-21)在心肌細胞中高表達，參與許多心血管疾病如缺血性心肌病、心肌肥厚、心力衰竭等病理生理過程。miRNA未來可能成為DCM的治療新靶點[2]。miR-21介導的心血管效應的靶基因有4個，分別是程序性細胞死亡因子4(PDCD4)、磷酸脂酶-張力蛋白同源物(PTEN)、sprouty1(SPRY1)和sprouty2(SPRY2)。其中PTEN是迄今發現的唯一具有蛋白脂酶和磷酸酶雙特異活性的靶基因,通過復雜的信號轉導通路，如：磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)、黏著斑激酶(FAK)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、p53/雙微體2(MDM2)、NF-κB在增生性血管疾病、缺血性心肌病、心臟肥大、心力衰竭和心臟纖維化等心血管疾病中發揮重要作用[3]。本研究小組在前期細胞和動物實驗中發現，miR-21能通過負性調控PTEN抑制心肌細胞凋亡和心力衰竭的發生發展，PTEN/Akt/叉頭框蛋白(FOX)O3a信號轉導通路參與其中[4-5]。本研究旨在檢測DCM患者血清miR-21和PTEN的表達水平，結合超聲心動圖相關指標和N末端B型鈉肽前體(NT-proBNP)行相關性分析，探討血清miR-21和PTEN在DCM患者中的臨床意義，為DCM的診斷和治療開辟新的方向。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇 2017年5—12月在南華大學附屬第一醫院心血管內科住院的DCM患者40例為DCM組，其中男30例、女10例；平均年齡 (62.5±2.1)歲；另選擇同期同一醫院行體格檢查的健康者20例為正常組，其中男10例、女10例；平均年齡(61.9±1.8)歲。DCM的診斷參照WHO/國際心臟病學會聯合會(ISFC)的診斷標準。本研究通過南華大學附屬第一醫院倫理委員會審核批準。兩組受檢者均為自愿參加并簽署知情同意書。排除標準：繼發性糖尿病、惡性腫瘤、外傷、感染、貧血和自身免疫性疾病、長期服用激素類藥物的患者。

1.2 方法

1.2.1 觀察指標 采集兩組受檢者清晨空腹肘靜脈血3 mL，檢測血清NT-proBNP水平；同時另留取肘靜脈血5 mL，置于真空無抗凝管中,樣本置于離心機中，1 h內4 ℃,3 000 r/min離心15 min(離心半徑為10 cm)，將上層液轉移至1.5 mL eppendorf管中12 000 r/min離心5 min(離心半徑5 cm)， 再將上層血清轉移至新1.5 mL eppendorf管中，標記并將其分裝，保存于-80 ℃冰箱，樣本處理于2 h內完成。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應 (qRT-PCR)檢測血清miR-21和PTEN mRNA的表達水平，ELISA法檢測各組血清PTEN蛋白質的表達水平。由本院超聲科醫師對兩組受檢者進行超聲心動圖檢查，測量左心室舒張末內徑(LVEDd)、左心室射血分數 (LVEF)、舒張早期/舒張末期心室充盈速率(E/A)。

1.2.2 主要儀器和試劑 全自動生化儀為瑞士羅氏公司產品，定量熒光PCR儀為美國ABI生物公司產品。QIAzol裂解液、miRNeasy 血清(血漿)提取試劑盒購自德國Qiagen公司，PrimeScrip?miRNA cDNA一步合成試劑盒、SYBR?Green熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，1 kp DNA ladder標志物購自美國Fermentas公司，miR-21、PTEN mRNA、 β-actin和U6引物購自上海捷瑞生物有限公司，ELISA試劑盒購自上海BG公司。

1.2.3 血清miR-21和PTEN mRNA相對表達量 ①總RNA提取：取200 mL血清與5倍體積的QIAzol裂解液混勻，靜置15 min后提取總RNA，按miRNeasy 血清(血漿)提取試劑盒操作說明進行，用氯仿去蛋白質處理，乙醇沉淀RNA成分，加入12 mL DEPC水溶解RNA。②cDNA合成：按照PrimeScrip?miRNA cDNA一步合成試劑盒說明書將所提取的RNA合成cDNA，反應條件為37 ℃ 60 min聚合腺苷酸(PolyA)加尾和反轉錄反應，85 ℃ 5 s酶失活，合成20 μL反轉錄液，將其稀釋5倍用于PCR分析。③PCR：參照日本TaKaRa公司SYBR?Green熒光定量PCR試劑盒說明方法制備 20 μL反應體系，于 ABI 7500熒光定量PCR儀中擴增，miR-21正向引物為5’-CCT GCC TGA GCA CCT CGT GC-3’,反向引物為5’-GAC TGT GAC GAC TAC CCC AA-3’，產物75 bp。預變性94 ℃ 2 min，變性94 ℃ 20 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40～45個循環。內參基因U6正向引物為5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，反向引物: 5’ -AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’，產物109 bp。預變性94 ℃ 2 min，變性94 ℃ 20 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40～45個循環。PTEN mRNA正向引物為 5’-TCA TGG TGC TGG TGG CTC TG-3’，反向引物為5’ -TGT GCT GGG GTT GGC TAT TT-3’，產物146 bp。預變性94 ℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，40個循環。內參基因β-actin正向引物為5’-CCT CAA GAT TGT CAG CAA T-3’，反向引物為5’-CCA TCC ACA GTC TTC TGA GT-3’，產物103 bp。預變性94 ℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，40個循環。所有引物均由上海捷瑞生物公司提供，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用2-△△Ct比較法計算miR-21相對表達量。

1.2.4 血清 PTEN 蛋白質相對表達量 測定所有入組患者的血清標本中PTEN 蛋白。按ELISA試劑盒說明書操作，酶標儀型號為Bio-Red 680，在波長為 450 nm處測定吸光度。

2 結 果

2.1 兩組血清NT-proBNP水平和超聲心動圖檢查結果比較 DCM組血清NT-proBNP水平和LVEDd均高于正常組(t=5.80、37.42，P值均<0.05)；LVEF、E/A均顯著低于正常組(t=46.71、14.41，P值均<0.05)。見表1。

組別NNT-proBNP(ng/L)LVEDd(mm)LVEF(%)E/A正常20130.97±44.3039.10±2.2959.35±1.401.39±0.07DCM404 688.76±3 501.04①62.88±2.33①45.27±0.92①0.82±0.17①

與正常組比較：①P<0.05

2.2 血清miR-21相對表達量 DCM組miR-21相對表達量是正常組的(4.08±0.16)倍，差異有統計學意義(t=-88.12，P<0.05)。

2.3 miRNA表達量與各變量間的關系 Pearson線性相關分析顯示，miR-21表達量與NT-proBNP和LVEDd呈正相關(r=0.977、0.616，P值均<0.05)，與LVEF和E/A呈負相關(-0.985、-0.884，P值均<0.05)。多重線性相關分析顯示，血清miR-21表達量與LVEDd呈正相關(P<0.01)，見表2。

表2 miR-21表達量與各變量間的多重線性相關分析

2.4 血清 PTEN mRNA相對表達量 DCM組PTEN mRNA相對表達量是正常組的(0.27±0.03)倍，差異有統計學意義(t=91.52，P<0.05)。

2.5 PTEN mRNA表達量與各變量間的關系 Pearson線性相關分析顯示，PTEN mRNA表達量與LVEF和E/A呈正相關(r=0.983，P<0.01和r=0.879，P<0.05)，PTEN mRNA表達量與LVEDd、NT-proBNP水平和miR-21表達量呈負相關(r=-0.977，P<0.05；r=-0.607，P<0.05和r=-0.998，P<0.01)。多重線性相關分析顯示，血清PTEN mRNA表達量與LVEF呈正相關(P<0.01)，與miR-21和NT-proBNP水平呈負相關(P值均<0.05),見表3。

表3 PTEN mRNA表達量與各變量間的多重線性相關分析

2.6 血清PTEN蛋白質相對表達量 DCM組PTEN蛋白質相對表達量是正常組的 (0.24±0.03)倍，差異有統計學意義(t=50.65，P<0.05)。

2.7 PTEN蛋白質相對表達量與各變量間的關系 Pearson線性相關分析顯示，PTEN蛋白質表達量與LVEF和E/A呈正相關(r=0.984，P<0.01；r=0.879，P<0.05)，PTEN蛋白質表達量與LVEDd、NT-proBNP和miR-21表達量呈負相關(r=-0.978，P<0.05；r=-0.607，P<0.05和r=-0.998，P<0.01)。多重線性相關分析顯示，血清PTEN蛋白質表達量與LVEF呈正相關(P<0.05)，與miR-21表達量和NT-proBNP水平呈負相關(P<0.05)，見表4。

表4 PTEN蛋白質表達量與各變量間的多重線性相關分析

3 討 論

DCM是一種以心肌結構和功能重構為特征的特異性心肌病， 其發生不依賴于冠心病、 高血壓和其他心臟疾病。其發病機制復雜，涉及心肌細胞凋亡、心肌纖維化、心肌代謝紊亂、心肌微血管病變、心肌自主神經病變、細胞因子異常等，目前未被完全了解。目前,DCM尚無特異性治療，一般采用控制血糖、抗心力衰竭等，療效欠佳，預后差。

miRNA是真核生物中一種長度約為22個核苷酸大小、參與基因轉錄后調控的非編碼單鏈小分子RNA，可特異性識別靶mRNA的3’-非編碼區(3’-UTR)并與之結合，從而降解靶mRNA，抑制翻譯，發揮其對基因的轉錄后表達調控，調節重要的細胞活動，參與眾多疾病的病理生理過程[1]。近來研究表明，miRNA通過調控心肌細胞肥厚、凋亡、心肌纖維化、線粒體功能障礙、心室重構、內皮細胞修飾等方面在DCM的病理生理過程中發揮關鍵作用，干預miRNA可能會影響DCM的病情進展，未來可能成為DCM的治療新靶向[2]。miR-21是其中一種由單個基因編碼的、定位在染色體17q23.2，與編碼跨膜蛋白的基因VMP1(或TMEM49)重疊，并獨立地由miR-21前轉錄本(如pri-miRNA -21)中一個相對保守的啟動子轉錄而成[6]的miRNA，其在心肌組織和許多主要的心血管細胞類型包括血管平滑肌細胞、血管內皮細胞、心肌細胞和心臟成纖維細胞上高表達，在許多心血管疾病如心肌梗死、心力衰竭、心臟肥大中呈差異性表達，參與各種心血管疾病的病理生理分子機制[2]。近年來miR-21在心血管生理和病理過程中的作用備受關注[7]。本研究結果顯示，DCM血清NT-proBNP水平和LVEDd均顯著高于正常組，LVEF和E/A均顯著低于正常組；血清miR-21水平明顯升高，且其表達水平與LVEDd、NT-proBNP呈正相關，與LVEF和E/A呈負相關，血清NT-proBNP水平升高，LVEF降低是心力衰竭的表現；LVEDd增大是心室重構的大體表現，基因分子水平表現為多種細胞因子水平異常、信號轉導通路調控異常等。提示血清miR-21很可能參與DCM的發生發展，未來可能成為DCM危險分層的新診斷標志物和潛在的治療新靶點。

miR-21介導的心血管效應的靶基因，分別為PDCD4、PTEN、SPRY1和SPRY2，這4個靶基因具有明顯細胞和條件特異性[8]。PTEN基因在胚胎發育，細胞生長、分化、凋亡和遷移的調控中發揮重要作用。Oudit等[9]發現，miR-21通過調控PTEN/AKT通路延緩心室重構和心力衰竭的進展。Yang等[10]發現，曲美他嗪能激活PTEN/Akt信號通路上調miR-21的表達從而抑制缺血再灌注導致的心肌損傷。Tao等[11]發現，生長抑制因子-5可能通過調控miR-21的表達來抑制心肌纖維化，PTEN/Akt通路可能參與其中。Haque等[12]發現，miR-21可能通過調控PTEN/Akt通路水平對糖尿病視網膜病變發揮潛在性的靶向治療作用。Wang等[13]發現，過表達子宮內膜間充質干細胞的miR-21水平可能通過調控PTEN/Akt通路對心肌細胞起保護作用。Shi等[14]發現，miR-21可能通過調控PTEN/PI3K/Akt通路促進心肌干細胞的增殖，未來可能對缺血性心臟病的治療發揮潛在作用。本研究結果發現，DCM組血清PTEN mRNA和蛋白質表達量均明顯降低，且與LVEF和E/A呈正相關，與LVEDd、NT-proBNP、miR-21表達量呈負相關。因此推測，在DCM中，高表達的miR-21可能通過與PTEN基因結合，負性調節PTEN的表達，發生轉錄后基因沉默，在翻譯水平抑制靶基因的表達，在DCM的病理生理機制中發揮重要作用。