上皮性卵巢癌組織OIP5表達及其意義

[摘要]目的 探討OPA相互作用蛋白5（OIP5）在上皮性卵巢癌組織中的表達及臨床病理學意義。方法"選擇90例上皮性卵巢癌組織及配對的癌旁正常組織標本，運用免疫組化技術檢測OIP5的表達及細胞定位。結果"與癌旁正常組織相比，OIP5蛋白在卵巢癌組織中表達明顯升高（χ2=14.100，P<0.05），且其表達水平與卵巢癌的N分期、遠端轉移和不良預后等顯著相關，差異均有統計學意義（χ2=5.000～10.106，P<0.05）。結論 OIP5在卵巢癌的發生發展中可能起著癌基因的作用。

[關鍵詞]卵巢腫瘤;OPA相互作用蛋白5;腫瘤轉移;預后;病理學，臨床

[中圖分類號]R737.31

[文獻標志碼]A

[文章編號] 2096-5532（2019）05-0560-05

doi：10.11712/jms201905014

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

上皮性卵巢癌 （EOC）是一種常見的婦科惡性腫瘤，占卵巢腫瘤的50%～70%。由于EOC早期 （Ⅰ、Ⅱ期）缺乏典型的臨床表觀，大約76%的病人在就診時往往處于癌癥晚期階段 （Ⅲ、Ⅳ期），發現時已有腹腔、肝、胸腔或顱內轉移和種植，這是導致EOC較高病死率的主要原因。目前，EOC的侵襲和轉移機制尚不明確。隨著分子生物學的發展，人類基因組計劃已極大的豐富了人類對腫瘤發生發展的分子機制認識，各種實驗平臺技術被用來發現和鑒定癌癥相關基因或者治療的靶標。OPA相互作用蛋白5（OIP5）基因最初被鑒定為OPA互作蛋白5[1-3]。PAWLAK等[4]研究顯示，OIP5在一些腫瘤組織或者正常組織中均有表達。OIP5在細胞增殖的G1期或者細胞在靜止、衰老與分化完畢時呈上調表達[1];亦有研究發現其對中心體或著絲粒的結構和功能是必要的，OIP5在細胞末期G1期的中心體上聚集，介導染色質和細胞周期的調控[2]。目前相關研究結果表明，OIP5參與了胃癌、結直腸癌、肺癌、食管癌、腎透明細胞癌、急性髓樣白血病、膠質母細胞瘤、乳癌、肝癌和膀胱癌等疾病的發生和發展[5-13]。但OIP5在EOC組織中的表達目前尚未見有研究報道。為了明確OIP5在EOC中的表達及其與臨床病理學的相關性，本文研究運用免疫組化技術對90例EOC及配對癌旁正常組織中的OIP5表達進行了檢測?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2010—2016年，我科診治EOC病人 90例，年齡46～83歲，中位年齡61.5歲。根據美國癌癥聯合會 （AJCC） 2016年第8版TNM分期標準[1]：Ⅰ期10例，Ⅱ期33例，Ⅲ期34例，Ⅳ期13例;T1+T2期34例，T3+T4期56例;淋巴結轉移72例，無淋巴結轉移18例;遠端轉移60例，無遠端轉移30例;黏液型卵巢癌18例，漿液型卵巢癌46例，子宮內膜型卵巢癌14例，卵巢移行細胞癌5例和卵巢透明細胞癌7例。本研究通過了醫院醫學倫理委員會的批準，病人均知情同意。

1.2 免疫組化方法

EOC組織切片于60 ℃烤箱中過夜后，依次經二甲苯脫蠟、梯度乙醇溶液水化后浸泡于蒸餾水中待用。OIP5蛋白采用檸檬酸進行組織抗原修復：取200 mL修復緩沖液于耐高溫的修復盒，將脫蠟水化后的組織切片置于切片架上，放入緩沖液中，將修復盒放入微波爐中，調至解凍溫度，20 min后取出，冷卻至室溫，取出玻片，先用蒸餾水沖洗2次，每次5 min，之后再用磷酸鹽緩沖液（pH值7.2～7.4）沖洗2次，每次5 min。甩去PBS液后，每張切片加200 μL的兔抗人OIP5抗體（稀釋度1∶100，Abcam公司），放入濕盒內，置于4 ℃冰箱內過夜。甩去PBS液，每張切片加200 μL辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術公司），37 ℃恒溫箱內孵育30 min。PBS沖洗3次，每次5 min。甩去PBS液，每張切片加200 μL新鮮配制的DAB溶液，光學顯微鏡下控制顯色，并及時終止反應。自來水沖洗，蘇木精復染20 s，用自來水沖洗30 min，使切片返藍。切片經過梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封固。以已知陽性的病例作為陽性對照，以正常兔IgG代替一抗作為免疫組化實驗的陰性對照。

1.3 免疫組化評分

OIP5蛋白表達定位于細胞膜和細胞漿，均為棕黃色、棕褐色顆粒。陽性細胞數比例評分：陽性表達細胞<5%為0分，5%～20%為1分，21%～50%為2分，>50%為3分。陽性細胞表達染色強度評分：基本不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。綜合陽性細胞數比例和染色強度，以兩者之和為最后得分判斷：0～1分為陰性（-），2分為弱陽性（+），3～4分為中陽性（），5～6分為強陽性（）。在低倍鏡（100倍）下觀察整張切片，隨機選擇4個高倍視野（200倍）計數陽性細胞。最后以陰性和弱陽性表達為OIP5低表達組、中陽性和強陽性為OIP5高表達組進行臨床病理學參數的相關性分析。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件對所得結果進行數據處理和分析，計數資料的組間比較用χ2檢驗。生存資料單因素分析采用Kaplan-Meier法，差異的顯著性分析采用Log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OIP5在卵巢癌組織中的表達

免疫組化結果顯示，OIP5陽性顆粒定位于細胞膜和細胞質/漿中。OIP5的表達具有高度的異質性，其在腫瘤組織中的表達從陰性、弱陽性到中陽性表達。90例EOC組織中，OIP5陰性表達者18例，弱陽性表達者20例，中陽性表達者52例，未見強陽性表達。在正常組織中OIP5呈陰性表達的有73例，中陽性表達的有17例。與癌旁正常組織相比，OIP5在EOC組織中顯著性上調，其差異具有統計學意義（χ2=14.100，P<0.05）。見圖1。

2.2 OIP5高表達與EOC臨床病理特征的相關性

本文結果表明，OIP5的表達水平與N分期和遠端轉移有關，差異具有統計學意義（χ2=5.000、8.221，P<0.05）。與其他臨床病理學參數，比如病人年齡、T分期、臨床分期、腫瘤大小和病理學分型等均不具有統計學相關性（Pgt;0.05）。值得注意的是，雖然OIP5的表達與病理學分型不具有統計學相關性，但是具有統計學差異的趨勢（P=0.068）。即在黏液型、漿液型、子宮內膜型及混合型卵巢癌組織中，OIP5蛋白在漿液型EOC組織中傾向性高表達。見表1。

2.3 OIP5表達與EOC病人預后的關系

本文90例EOC病人中，手術時間為2010—2016年，生存時間0.5～37.5個月，平均21.38個月。存活24例，死亡66例;OIP5高表達52例，低表達38例。Long-rank分析顯示，OIP5的表達與不良預后具有統計學意義相關性（χ2=10.106，Plt;0.01）。其表達水平越高，總生存率越低。見圖2。

3 討論

在本研究中，我們報道了OIP5在EOC組織中的表達水平及其臨床病理學意義。本文結果表明，OIP5在EOC組織中相比癌旁正常組織顯著性上調;且OIP5表達與卵巢癌的N分期、遠端轉移和不良預后等具有顯著相關性，提示OIP5可能參與了EOC的發生發展。

在惡性腫瘤中，最先開展OIP5的研究是在胃癌中，隨后陸續地在結直腸癌、肺癌、食管癌、腎透明細胞癌、急性髓樣白血病、膠質母細胞瘤、乳癌、肝癌和膀胱癌等中均發現OIP5呈上調表達[5-13]，這與本研究的結果是一致的。這些研究結果提示，OIP5在A為黏液型卵巢癌組織，B為漿液型卵巢癌組織，C為子宮內膜型卵巢癌組織，D為正常卵巢組織。A、B、C表示OIP5中陽性表達;B1表示弱陽性表達;B2、D表示陰性表達或不表達。圖中比例尺為200 μm。

惡性腫瘤中可能是一個癌基因，參與了癌癥的發生發展及惡性表型。CHUN等[6]運用RT-PCR技術對66例結腸癌組織和9例正常組織的檢測結果顯示，OIP5在腫瘤組織中的表達是其在正常組織的3.7倍;但是OIP5的表達與臨床分期（Ⅱ期和Ⅲ期之間）和復發與否（復發與非復發之間）均無顯著相關性。本研究結果與其一致，這說明OIP5的表達不太可能作為EOC臨床分期的一個潛在標志物。KOINUMA等[7]在336例非小細胞性肺癌和305例食管鱗癌中分析OIP5表達的臨床病理學意義，結果顯示，OIP5的表達與非小細胞性肺癌和食管鱗癌的預后均具有統計學相關性。并且通過多因素分析確認了OIP5的表達在非小細胞性肺癌中是一個獨立的預后因素。本研究結果與其基本一致。由于本研究未進行多因素分析，因而無法得出OIP5的表達水平是否在EOC中是一個獨立的預后因素。因此，這需要在后續研究中用較大樣本進行確認。GONG等[8]運用免疫組化技術檢測OIP5在腎透明細胞癌表達的結果表明，其表達不僅與T分期、N分期和臨床分期有關，而且多因素分析顯示OIP5還是腎透明細胞癌的一個獨立預后因素。這與我們的研究有所不同。本研究結果未顯示，OIP5的表達與T分期和臨床分期無顯著相關性。其差異可能與使用的抗體不同或者使用的組織標本不同有關。OIP5已被證實為是一種組織特異性基因，其表達具有一定的組織特異性[5]。此外，OIP5在膀胱癌中亦被鑒定為發揮著癌基因的作用[13]。在乳癌中OIP5被發現除了介導染色質結構之外，在調控細胞周期及有絲分裂中正常染色體分離等方面起著重要的作用[11]。盡管如此，有關OIP5的分子機制的研究鮮有報道。研究發現，在肝細胞癌中OIP5參與了腫瘤細胞的增殖和轉移，該作用是通過miR-15-5p調控OIP5來完成的[12]。在乳癌中OIP5是通過miR-139-5p/NOTCH1通路而起作用的[16]。OIP5在EOC中的作用機制尚不明確，有待于進一步研究。由于其機制研究離不開體外細胞培養系統，在本研究中我們未能開展體外EOC細胞系培養工作，因而有關其具體的生物學功能及相關機制尚不明確，需要在后續實驗中進一步研究探討。此外，在我們的研究中，仍有兩點需要注意。首先，由于免疫組化的評分有較大的主觀性，因此免疫組化的評分標準可能會潛在地影響最終統計學相關性分析。其次，鑒于OIP5在EOC組織中表達的高度異質性，在本研究中我們只使用了一種實驗方法探討OIP5在卵巢癌組織中的表達或許不夠充分。免疫印跡或者實時熒光定量PCR技術可能是免疫組化的一個強有力的實驗技術驗證或補充。

總之，本研究結果顯示EOC組織中OIP5表達顯著上調;上調表達的OIP5與卵巢癌的N分期、遠端轉移和不良預后等顯著相關，提示OIP5可能參與了EOC的發生發展。鑒于本研究的樣本例數有限，因而有必要在后續實驗中進行多中心大樣本的實驗驗證。

[參考文獻]

[1]NAETAR N， HUTTER S， DORNER D， et al. LAP2 alpha-binding protein LINT-25 is a novel chromatin associated protein involved in cell cycle exit[J]. Journal of Cell Science， 2007，120（5）：737-747.

[2]FUJITA Y， HAYASHI T， KIYOMITSU T， et al. Priming of centromere for CENP-A recruitment by human hMis18alpha， hMis18beta， and M18BP1 [J]. Developmental Cell， 2007，12（1）：17-30.

[3]WILLIAMS J M， CHEN G C， ZHU L， et al. Using the yeast two-hybrid system to identify human epithelial cell proteins that bind gonococcal Opa proteins： intracellular gonococci bind pyruvate kinase via their Opa proteins and require host pyruvate for growth[J]. Molecular Microbiology， 1998，27（1）：171-186.

[4]PAWLAK A， TOUSSAINT C， LEVY I， et al. Characterization of a large population of messenger-rnas from human testis[J]. Genomics， 1995，26（1）：151-158.

[5]NAKAMURA Y， TANAKA F， NAGAHARA H， et al. Opa interacting protein 5 （OIP5） is a novel cancer-testis specific gene in gastric cancer [J]. Annals of Surgical Oncology， 2007，14（2）：885-892.

[6]CHUN H K， CHUNG K S， KIM H C， et al. OIP5 is a highly expressed potential therapeutic target for colorectal and gastric cancers[J]. BMB Reports， 2010，43（5）：349-354.

[7]KOINUMA J， AKIYAMA H， FUJITA M A， et al. Characterization of an Opa interacting protein 5 involved in lung and esophageal carcinogenesis[J]. Cancer Science， 2012，103（3）：577-586.

[8]GONG Mancheng， XU Yangyang， DONG Wenjing， et al. Expression of Opa interacting protein 5 （OIP5） is associated with tumor stage and prognosis of clear cell renal cell carcinoma [J]. Acta Histochemica， 2013，115（8）：810-815.

[9]YAZARLOO F， SHIRKOOHI R， MOBASHERI M B， et al. Expression analysis of four testis-specific genes AURKC， OIP5， PIWIL2 and TAF7L in acute myeloid leukemia： a gender-dependent expression pattern [J]. 2013，30（1）：368.

[10]PEREIRA FREITAS M R， FLEURY MALHEIROS S M， BIASSI T P， et al. Expression of cancer/testis antigens is correlated with improved survival in glioblastoma [J]. Oncotarget， 2013，4（4）：636-646.

[11]MOBASHERI M B， SHIRKOOHI R， MODARRESSI M H. Cancer/Testis OIP5 and TAF7L genes are up-regulated in breast cancer[J]. Asian Pacific Journal of"cancer prevention： APJCP， 2015，16（11）：4623-4628.

[12]LI H， ZHANG J， LEE M J， et al. OIP5， a target of miR-15b-5p， regulates hepatocellular carcinoma growth and metastasis through the AKT/mTORC1 and beta-catenin signaling pathways[J]. Oncotarget， 2017，8（11）：18129-18144.

[13]HE Xuefeng， HOU Jianquan， PING Jigen， et al. Opa interacting protein 5 acts as an oncogene in bladder cancer [J]. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology， 2017，143（11）：2221-2233.

[14]BAKER M. Reproducibility crisis： blame it on the antibodies [J]. Nature， 2015，521（7552）：274-276.

[15]HOLMSETH S， ZHOU Y， FOLLIN-ARBELET V V， et al. Specificity controls for immunocytochemistry： the antigen preadsorption test can Lead to inaccurate assessment of antibody specificity [J]. Journal of Histochemistry amp; Cytochemistry， 2012，60（3）：174-187.

[16]LI Hongchang， CHEN Yafeng， FENG Wen， et al. Loss of the Opa interacting protein 5 inhibits breast cancer proliferation through miR-139-5p/NOTCH1 pathway [J]. Gene， 2017，603：1-8.

（本文編輯 于國藝）