多發性骨髓瘤中異常表達的長鏈非編碼RNA的作用機制及臨床應用研究進展

沈敏，黃梅

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，武漢 430030)

多發性骨髓瘤(MM)是骨髓漿細胞的異常克隆增殖性疾病，約占血液惡性腫瘤的10%，為血液系統第二常見的腫瘤[1]。近年來新型診療技術雖很大程度改善了患者生存預后，但MM仍不可治愈，疾病復發仍是該病的普遍特征。隨著全基因組測序技術的發展，人們對MM的診治模式逐漸向精準醫療模式轉變。長鏈非編碼RNA(lncRNA)指長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，不具有編碼蛋白質的開放閱讀框，但可與DNA、RNA和蛋白質相互作用。通過染色質重塑、可變剪接、調控細胞周期及生長分化、組蛋白修飾、轉錄干擾、基因印記等方式，在表觀遺傳學、轉錄水平、轉錄后水平參與基因調控或形成調控的表達網絡，產生致癌或抑癌生物學功能，最終對腫瘤的發生發展、侵襲轉移、診斷預后及治療產生不同程度影響。本文重點針對目前國內外對于lncRNA在MM中的研究成果進行綜述，分析對功能性lncRNA調控的分子機制，探討其在MM診斷、預后及治療的臨床應用價值。

1 lncRNA的分類及生物學功能

隨著基因組測序技術的發展，人們發現非編碼基因占全人類基因組98%以上。lncRNA在哺乳動物轉錄組非編碼RNA中占很大比例。曾因其表達量低、保守性差及滯留胞核內等特點，lncRNA功能一直被忽視，長期以來被認為是“垃圾序列”或“轉錄噪音”。而近年來研究表明，lncRNA在細胞調控網絡中發揮巨大作用。lncRNA根據染色體上編碼基因的位置、調控類型和作用模式，大概可分為：基因間型、內含子型、正義型、反義型、反向型、啟動子上游型、啟動子型、轉錄起始位點型[2]。lncRNA的調控機制十分復雜，目前對lncRNA的生物學功能研究主要集中于：染色體重塑，激活/抑制基因；轉錄的調控；表觀遺傳學調控；調節mRNA可變剪接；穩定mRNA的結構；調節翻譯過程；miRNA分子海綿；改變蛋白質定位及活性；翻譯產生短肽(圖1)[3,4]。

圖1 lncRNAs調控機制模式圖

2 MM中異常表達lncRNA及其調控機制

2.1 高表達的lncRNA及其促癌機制

2.1.1 MALATl MALATl是研究最多的lncRNA之一,定位于人染色體11q13，在多種實體瘤中證實呈高表達。Li等[5]研究MM骨髓間充質干細胞(MSCs)的MALAT1的生物學功能發現，MALATl通過提高MSCs中轉錄因子Sp1的活性，并形成MALATl-Sp1復合體，隨后招募促進Sp1至LTBP3基因的啟動子區域，增強其表達并調控下游的TGF-β而發揮作用。Liu等[6]體內外實驗發現，沉默MALAT1后可使MM細胞周期阻滯于G1期，并通過激活Caspase-3/-9、上調Bax、下調Bcl-2表達促進MM細胞凋亡。Amodio等[7]設計靶向抑制MALAT1的探針(g#5)，發現MALAT1依賴的蛋白酶體調控機制是通過NRF1-2/KEAP通路實現的。特異性拮抗MALAT1表達后可通過負性調控因子KEAP1，降低蛋白酶體轉錄活化因子NRF1和NRF2的活性，最終導致胰蛋白酶、糜蛋白酶和Caspase樣蛋白酶體活性降低，多聚泛素化蛋白富集；反過來NRF1又可促進MALAT1表達，并形成了正反饋環而發揮調控MM作用。Gu等[8]采用qRT-PCR從細胞、動物及臨床樣本三個層面檢測MALAT1表達水平，表明其主要機制是調控MALAT1/miR-509-5p/FOXP1軸實現，即MALAT1作為miR-509-5p的競爭性內源性RNA(ceRNA)，吸附miR-509-5p分子后直接作用于FOXP1的3′-UTR端，并對其表達產生正性調控作用。Gao等[9]對MALAT1生物學功能研究發現，MALAT1可以上調MM細胞中HMGB1的表達，促進自噬減少腫瘤細胞凋亡而發揮促癌效應。Handa等[10]認為化療藥物硼替佐米、多柔比星可上調MALAT1在MM細胞系中表達，且與髓外多發性骨髓瘤(EMM)發生及預后密切相關。Hu等[11]體內外實驗研究表明，MALAT1結合于PARP1/LIG3蛋白復合體而發揮對腫瘤細胞DNA保護和抗凋亡作用。Gao等[12]發現miR-125b與MALAT1存在互補結合區，MALAT-1通過Notch1信號通路而調控MM細胞增殖，沉默細胞系NCI-H929和PRMI8226中MALAT1的表達，Notch1、HES1、Bcl-2表達均降低，而促凋蛋白c-caspase3明顯增加。上述機制研究均證明了MM中高表達的MALATl是參與促癌調控的分子。

2.1.2 NEAT1 NEAT1位于人類第11號染色體上，具有兩個單體形式，即NEAT1-1(3.7 kb)和NEAT1-2(23 kb)。Wu等[13]發現NEAT1在地塞米松(DEX)耐藥的MM細胞株中高表達，NEAT1作為分子海綿黏附miR-193a并使其表達下調，最終導致抗凋亡蛋白MCL1增加。下調NEAT1后，可顯著增強耐藥株對DEX的敏感性。Geng等[14]證明MM細胞中過表達的NEAT1可誘導增殖、遷移、侵襲，而中藥白藜蘆醇可通過下調NEAT1而遏制此效應，進而抑制Wnt/β-catenin信號通路而發揮抗MM作用。

2.1.3 H19 H19是第一個被發現的lncRNA，于1991年被Bartolomei等報道[15]。H19位于人染色體11p15.5，是印記DLK1-MEG3基因上的一個印記基因。Sun等[16]驗證了H19在MM中呈高表達，沉默H19后發現可抑制MM細胞生長，并在阻滯NF-κB信號通路的同時抑制細胞因子(IL-6、IL-8)的釋放，由此表明H19與NF-κB信號通路共同作用調控MM細胞生長。

2.1.4 PDIA3P PDIA3P定位于人染色體1q21.1，長度為2 099 bp，已證實在口腔鱗狀細胞癌中通過負性調控miR-185-5p，并激活Cyclin D2表達促進腫瘤細胞的增殖[17]。Yang等[18]通過qRT-PCR檢測發現，PDIA3P在MM細胞株及患者中明顯高表達，與轉錄因子c-Myc相互作用，增強其表達活性后結合于G6PD啟動子區域，刺激其表達并影響磷酸戊糖途徑代謝，最終促進細胞增殖及耐藥。

2.1.5 CRNDE CRNDE最初是在直腸癌中被鑒定出來，位于人染色體16q12.2，在許多癌組織中均表現為異常高表達。Meng等[19]通過檢測MM臨床樣本及細胞系，發現高表達的CRNDE具有促進MM發生發展的作用，同時與預后不良顯著相關。進一步機制研究表明，CRNDE作為ceRNA和分子海綿，負性拮抗miR-451分子，從而促進MM細胞增殖和發揮抗MM凋亡作用。

2.1.6 UCA1 UCA1位于人染色體19p13.12，包括3個外顯子，并編碼2個轉錄本。已證實在膀胱癌、胃癌、乳腺癌及直腸癌等惡性腫瘤中呈高表達而產生促癌作用。Zhang等[20]采用qRT-PCR檢測技術發現在MM患者臨床樣本和細胞株UCA1呈高表達，其促增殖和抗凋亡的作用主要是通過調控細胞內的TGF-β活性來實現的。

2.1.7 CCAT1 CCAT1定位于人類染色體組8q24.21，長度為2 628 bt，與基因突變熱點區轉錄因子c-Myc相鄰，已證實具有促進腫瘤的增殖和侵襲作用。Chen等[21]發現下調CCAT1表達具有抑制MM細胞增殖、阻滯細胞周期及促進凋亡作用。在過表達實驗中，高表達的CCAT1作為miR-181a-5p的分子海綿降低其表達，并對下游的HOXA1發揮正性調控作用，從而促進MM疾病的發生發展。

2.1.8 FEZF1-AS1 FEZF1-AS1是FEZF1基因的反義鏈，定位于人類7號染色體，可編碼產生一個長2 564 nt的轉錄本，目前已證實與腫瘤細胞的增殖遷移能力相關。Li等[22]通過qRT-PCR、RNA免疫共沉淀、熒光素酶報告實驗發現，lncRNA FEZF1-AS1作為miR-610的ceRNA，吸附并降低MM細胞內miR-610表達水平，最終對其下游Akt3產生正性調控作用而發揮抗MM效應。

2.1.9 其他 除了上述異常高表達的lncRNA可促進MM的發生發展，人們還發現linc00515可以通過促進自噬，增強MM對馬法蘭的耐藥產生促癌效應。其主要作用機制是直接抑制miR-140-5p后，上調ATG14表達水平而促進MM發生[23]。最近，Li等[24]證實了MM細胞的外泌體可以包裹RUNX2-AS而形成外泌體lncRNA,并傳送到MSCs內發揮作用。RUNX2-AS1可與RUNX2的前體mRNA在重疊區域形成雙鏈RNA，這種雙鏈結構降低了剪接效率從而抑制RUNX2的表達，最終導致MSCs的成骨分化活性降低。

2.2 低表達的lncRNAs及其抑癌機制

2.2.1 MEG3 MEG3是2000年Miyoshi等[25]首次鑒定出來的印記基因，其長度長約1.6 kb，位于人染色體14q32。Zhuang等[26]從分子層面上闡明了MEG3促進MSCs細胞成骨分化的機制，認為MEG3敲低可下調成骨標志物RUNX2、Osterix及骨鈣素的表達，并抑制骨形態發生蛋白4(BMP4)的轉錄。其機理是下調的MEG3使轉錄因子SOX2與BMP4的啟動子分離。MEG3、SOX2及BMP4的SOX2共識位點可組成穩定復合物，其中MEG3通過直接影響SOX2而激活BMP4轉錄。通過染色質免疫沉淀、RNA免疫共沉淀、熒光素酶報告等證實，MEG3對啟動子的特異性轉錄激活也起到促進成骨分化的作用。Shen等[27]體內外實驗研究了MEG3/miR-181a/HOXA11調控網絡，發現MEG3作為miR-181a的ceRNA發揮調控作用，下調MEG3可增加miR-181a水平，而miR-181a作為促癌分子，直接作用于抑癌基因HOXA11，抑制其表達而促進MM發展。

2.2.2 PRAL PRAL位于人染色體17p13.1，在肝細胞癌、肺癌等腫瘤中作為抑癌基因。Xiao等[28]通過檢測MM細胞增殖、ki67及凋亡蛋白Caspase-3的表達水平，發現PRAL可抑制MM細胞生長、促進凋亡、增強MM對硼替佐米的敏感性。其作用機制是競爭性吸附miR-210分子后上調骨形態發生蛋白2(BMP2)轉錄活性，而BMP2可提高硼替佐米抗MM效應。

2.2.3 OIP5-AS1 OIP5-AS1最初是從斑馬魚中鑒定出來的。OIP5-AS1位于人染色體15q15.1，調節腫瘤細胞的增殖生長。Yang等[29]體內外生物學功能實驗表明，敲低OIP5-AS1可增加MM細胞內促癌分子miR-410表達，并直接結合其下游作用靶點KLF10，使PTEN/PI3K/AKT信號通路激活而促進MM進展。由此可見，OIP5-AS1在MM中發揮抑癌調控作用。

3 lncRNA在MM中的臨床應用

3.1 診斷 lncRNA作為新的腫瘤預測標志物，其表達失調可為MM診斷提供重要的檢測依據。Sedlarikova等[30]采用PCR基因芯片分析了84例MM和25例健康志愿者的骨髓漿細胞(BMPCs)中lncRNA表達譜，并選取異常表達的UCAl和NEATl進行驗證，通過繪制受試者工作特征(ROC)曲線，發現NEATl的靈敏度為55.0%，特異度為79.0%，ROC的曲線下面積(AUC)為0.773；UCAl靈敏度為85%，特異度為94.7%，AUC為0.879。Zhuang等[26]研究發現，MM患者的MSCs在成骨分化的過程中，MEG3表達水平較健康對照明顯下降，提示MEG3具有作為新型生物標志物的潛力。此外，外周血中lncRNA檢測作為一種非侵入手段，同樣也具有十分重要的臨床應用價值。如：Pan等[31]采用RT-PCR技術檢測發現MM血清中H19穩定高表達。Shen等[32]通過研究60例MM患者臨床參數與血清PCAT-1水平相關性，發現PCAT-1的水平雖與性別、年齡、ISS分期、LDH水平、κ輕鏈和λ輕鏈濃度等參數無明顯的相關性，但是與患者β2微球蛋白濃度及MM分型密切相關。發現血清PCAT-1水平對MM診斷具有較高的靈敏度(71.7%)和特異度(93.8%)。由此可見，異常表達lncRNA作為新型診斷標志物不僅可表達于MM患者BMPCs和MSCs中，也可存在于患者外周血中，有望成為MM早期無創性診斷檢測及評價的可靠指標。

3.2 預后 越來越多的研究證據表明，lncRNA在臨床分期、危險分層和生存分析方面等存在重要的應用價值。Cho等[33]采用RT-PCR技術分析45例初診、61例治療后、18例復發或進展、20例健康對照的骨髓單個核細胞，結果顯示初診患者MALATl表達水平較健康對照明顯升高，且升高程度與疾病狀態具有顯著相關性；經治療后MALATl下降明顯組無進展生存(PFS)期較下降不明顯組明顯延長(分別為24個月和11個月)。Sedlarikova等[30]發現UCA1的水平與白蛋白、血紅蛋白、單克隆免疫球蛋白、細胞遺傳學、生物化學和分期(ISS和DS分期)以及MM患者生存率均密切相關。Kaplan-Meier曲線結果顯示，UCA1高表達組1年內病死率(37.6%)明顯高于低表達組(12.1%)。Ronchetti等[34]采用基因芯片技術研究了9例健康供者和259例惡性漿細胞疾病(包括20例意義不明單克隆丙種球蛋白血癥、33例冒煙型骨髓瘤、170例多發性骨髓瘤、36例漿細胞白血病)，發現了31個異常表達的lncRNA。其中lnc-LRRC47-1的表達在健康對照組中呈現明顯下降趨勢。lnc-SENP5-4、lnc-CPSF2-2和lnc-LRRC47-1的水平在MM初診與相應復發/漿細胞白血病階段具有顯著性差異。Xiao等[28]發現PRAL在MM細胞系和初診患者中明顯低表達，且低表達程度與ISS分期和DS分期顯著相關，生存分析發現PRAL低表達組的DSF和OS明顯低于高表達組。以上研究均表明，異常表達的lncRNA與MM臨床分期、危險分層及生存預后具有明顯的相關性，可成為MM預后預測的重要輔助手段，為判斷患者臨床預后提供新的思路。

3.3 治療 失調的lncRNA通常作為癌基因和抑癌基因發揮重要作用。lncRNA的組織特異性及在腫瘤中異常表達，為其作為MM治療的靶點提供了可能。Amodio等[7]在細胞實驗和活體動物實驗中發現，沉默MM中高表達的MALATl可明顯抑制細胞增殖能力及蛋白酶體活性，從而發揮治療的作用。NEAT1在MM細胞中高表達產生致癌作用，中藥白黎蘆醇通過抑制NEAT1過表達而抑制細胞的增殖、遷移及侵襲[14]。此外，恢復抑癌lncRNA表達也可以實現抗癌作用。將轉染PRAL表達載體后的MM細胞植入裸鼠模型，發現PRAL可以抑制細胞生長、促進細胞凋亡及增強MM對硼替佐米敏感性[28]。雖然大量實驗數據均表明，針對以lncRNA為導向的治療方案具有很大的潛力，但目前結果僅局限于MM細胞系及體外動物實驗的初步研究，且在治療靶點上鑒定仍是一個空白領域，故以lncRNA為治療策略的研究仍需要進一步發展。

近年來，隨著熒光原位RNA測序、高通量測序、交聯免疫沉淀、RNA反義純化等技術的發展，越來越多的研究表明，MM中表達失調的lncRNA與其發生發展、分化轉移、診斷治療及預后緊密相關。這些lncRNA參與不同的生物進程，可在組織或體液中呈穩定地特異性表達，使得lncRNA有望成為微創篩查診斷和預后評估的敏感分子標記物。但與MM相關lncRNA的研究還處于起步階段，絕大多數僅局限于體外細胞實驗及動物模型研究，作用機制也尚不明確。因此，尋找合適的生物學標志物，探索lncRNA對MM的調控機制，完善和改進MM的診斷和篩查方法仍具有重大臨床意義。