黃芩苷灌胃對(duì)病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

歐紅令，林亞發(fā)，林小亮

(?？谑械谒娜嗣襻t(yī)院，?？?571100)

病毒性心肌炎是由病毒感染引起的心肌實(shí)質(zhì)或間質(zhì)的局限性或彌漫性炎癥損傷的一種常見的心血管疾病[1]。目前認(rèn)為柯薩奇病毒B3型(CVB3)是病毒性心肌炎的主要致病因素之一，嚴(yán)重者可導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生，甚至出現(xiàn)不良事件[2,3]。一項(xiàng)基礎(chǔ)研究證實(shí)，CVB3感染小鼠心肌細(xì)胞凋亡持續(xù)存在[4]。另有研究證實(shí)，病毒性心肌炎猝死患者尸檢標(biāo)本較意外猝死患者心肌細(xì)胞凋亡率高出數(shù)倍[5]。因此，抑制病毒性心肌炎患者心肌細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，可能是延緩病毒性心肌炎患者病程進(jìn)展的有效途徑。黃芪總黃酮是中藥黃芪的有效成分之一，可明顯抑制病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致的凋亡，并明顯改善小鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)[6]。黃芩苷是唇形植物黃芩的有效成分之一，其具有抗凋亡、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等多種生物學(xué)作用[7]。黃芩苷的抗凋亡作用已經(jīng)被國內(nèi)外研究證實(shí)，但是其對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡作用卻鮮有報(bào)道。2017年12月～2018年2月，本實(shí)驗(yàn)采用黃芩苷灌胃病毒性心肌炎小鼠，并觀察小鼠心室重構(gòu)、心肌細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞線粒體凋亡通路的變化，探討黃芩苷對(duì)病毒性心肌炎小鼠心肌的保護(hù)作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑與儀器 黃芩苷(江北藥業(yè)，純度≥98%)；CVB3(Nancy株)購于吉林大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心病毒室，病毒原液效價(jià)為1×10-3TCID50/L；黃芪總黃酮(齊魯制藥有限公司)；氨基末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)試劑盒(上海晶抗生物工程公司)；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(美國Invitrogen公司)；Caspas-9、Caspas-3活性檢測(cè)試劑盒及細(xì)胞色素C抗體(美國Biovision公司)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，英國Abcam公司)；Caspase-9、Caspase-3抗體(中國博士德公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源、模型制備及分組 60只雄性Balb/c小鼠，SPF級(jí)，4周齡，體質(zhì)量13～15 g，購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(吉)2011-0004。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過?？谑械谒娜嗣襻t(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合其指導(dǎo)原則。將60只Balb/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，病毒性心肌炎組，黃芩苷低、中、高劑量組及黃芪總黃酮組，各10只。后五組于腹腔內(nèi)無菌注射0.1 mL內(nèi)含1×102TCID50 CVB3病毒液[8](1次/d，連續(xù)3 d)。黃芩苷低、中、高劑量組同時(shí)給予20、50、100 mg/(kg·d)灌胃[9]，1次/d，連續(xù)10 d。黃芪總黃酮組同時(shí)給予給予黃芪總黃酮0.35 mg/(kg·d)腹腔注射[8]，1次/d，連續(xù)10 d。對(duì)照組僅給予等體積0.9% NaCl溶液腹腔注射，1次/d，連續(xù)10 d。

1.3 心功能檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)第11天，運(yùn)用彩色超聲顯像儀檢測(cè)各組小鼠心臟功能指標(biāo)，包括左心室舒張末徑(LVIDd)、左心室收縮末徑(LVESd)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。首先采用10%水合氯醛0.2 g/kg腹腔注射麻醉小鼠，備皮，將麻醉好的小鼠仰臥于超聲診床上，使用高頻探頭，測(cè)定上述心功能指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)取4個(gè)完整心動(dòng)周期的測(cè)量平均值。

1.4 血清NT-proBNP水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。實(shí)驗(yàn)第11天，抽取各組小鼠腹主動(dòng)脈動(dòng)脈血5 mL，4 000 r/min離10 min，分別取上清液置于-80 ℃冰箱保存，靜置7 d檢測(cè)血清中NT-proBNP水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照ELISA法檢測(cè)說明書執(zhí)行。

1.5 心室肌細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞儀。制備單細(xì)胞懸液：實(shí)驗(yàn)第11天，各組分別取等體積心室肌組織，剪碎，胰酶消化20～25 min，取上清液，加入小牛血清終止消化；沉淀重復(fù)上述步驟，如此反復(fù)實(shí)驗(yàn)幾次，用300目尼龍網(wǎng)過篩去掉較大團(tuán)塊；低速(500 r/min)離心5 min，棄上清。沉淀加入生理鹽水，離心5 min，棄上清；重復(fù)3次，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞的濃度為3×106個(gè)/mL；取100 μL的細(xì)胞懸液加入1 mL的碘化丙啶，配成50 μg/mL液體(含RNA酶10 mg)，20 ℃避光保存，20 min后測(cè)定心肌凋亡指數(shù)；氬離子激光作為光源，于630 nm波長的光下，線形方式獲取細(xì)胞；在Celquest下進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用Macintosh系統(tǒng)進(jìn)行處理，凋亡率為第二象限+第四象限所占細(xì)胞比例。

1.6 心室肌細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀。單細(xì)胞懸液制作步驟同上。操作步驟嚴(yán)格按JC-1染色試劑說明書進(jìn)行，送流式細(xì)胞工作室檢測(cè)。正常線粒體內(nèi)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光(Ex=585 nm，Em=590 nm)；當(dāng)線粒體膜電位下降或喪失時(shí)，JC-1只能以單體的形式存在于胞質(zhì)中，產(chǎn)生綠色熒光(Ex=514 nm，Em=529 nm)。線粒體膜電位的變化通過紅/綠熒光強(qiáng)度的率來衡量，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取均值。

1.7 心室肌細(xì)胞Cyt C、Caspase-9、Caspase-3表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。提取各組小鼠心室肌細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定各組蛋白濃度，制備上樣液。取各組待測(cè)樣品20 μL和5 μL蛋白標(biāo)記，加至SDS-PAGE電泳裝置中，進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后脫脂牛奶封閉2 h，加入相應(yīng)一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，緩沖液洗膜3次，加入山羊抗兔二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，緩沖液洗膜3次，化學(xué)發(fā)光顯像，暗室曝光，掃描膠片，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參GAPDH的灰度值。

1.8 心室肌細(xì)胞Caspase-9、Caspase-3活性檢測(cè) 單細(xì)胞懸液制備步驟同上。操作步驟嚴(yán)格按Caspase-9、Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心功能比較 見表1。

表1 各組小鼠心功能比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與病毒性心肌炎組相比，#P<0.05；與黃芩苷低劑量組相比，▲P<0.05；與黃芩苷中劑量組相比，△P<0.05。

2.2 各組小鼠血清NT-proBNP水平比較 對(duì)照組、病毒性心肌炎組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組及黃芪總黃酮組血清NT-proBNP水平分別為(114.25±12.71)、(375.66±44.45)、(328.10±44.85)、(268.55±32.15)、(183.65±27.48)、(236.57±35.44)ng/L，病毒性心肌炎組與對(duì)照組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組及黃芪總黃酮組相比，P均<0.05。

2.3 各組小鼠心室肌細(xì)胞凋亡率比較 對(duì)照組、病毒性心肌炎組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組及黃芪總黃酮組心室肌細(xì)胞凋亡率分別為4.7%、27.0%、21.0%、14.5%、8.6%及12.5%，病毒性心肌炎組與對(duì)照組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組及黃芪總黃酮組相比，P均<0.05。

2.4 各組小鼠心室肌細(xì)胞線粒體膜電位水平比較 對(duì)照組、病毒性心肌炎組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組及黃芪總黃酮組心室肌細(xì)胞線粒體膜電位分別為100.00±0.02、40.32±4.81、50.35±6.85、72.34±10.08、84.58±18.74、78.45±14.37，病毒性心肌炎組與對(duì)照組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組及黃芪總黃酮組相比，P均<0.05。

2.5 各組小鼠心室肌細(xì)胞Cyt C、Caspase-9、Caspase-3表達(dá)比較 見表2。

表2 各組小鼠心室肌細(xì)胞Cyt C、Caspase-9、Caspase-3表達(dá)比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與病毒性心肌炎組相比，#P<0.05；與黃芩苷低劑量組相比，▲P<0.05；與黃芩苷中劑量組相比，△P<0.05。

2.6 各組小鼠心室肌細(xì)胞Caspase-9、Caspase-3活性比較 見表3。

表3 各組小鼠心室肌細(xì)胞Caspase-9、Caspase-3活性比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與病毒性心肌炎組相比，#P<0.05；與黃芩苷低劑量組相比，▲P<0.05；與黃芩苷中劑量組相比，△P<0.05。

3 討論

病毒性心肌炎是一類常見的感染性心肌炎性疾病，臨床表現(xiàn)形式多樣，病程長短不一，部分急性患者可發(fā)展為慢性病毒性心肌炎或者擴(kuò)張型心肌病，最終發(fā)展為充血性心力衰竭，猝死率高達(dá)10%～44%[10]。近年來國內(nèi)外學(xué)者通過建立CVB3感染小鼠建立病毒性心肌炎模型及臨床大量病例分析證實(shí)，在病毒性心肌炎進(jìn)展中，心肌細(xì)胞的凋亡對(duì)疾病的轉(zhuǎn)歸起著十分重要的作用[11]。本研究采用CVB3病毒制備病毒性心肌炎小鼠模型，給予不同劑量黃芩苷灌胃進(jìn)行干預(yù)，明確藥物的劑量效應(yīng)關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，病毒性心肌炎組小鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯，而黃芩苷低、中、高劑量組均可有效降低病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡率、改善LVESd、LVIDd、LVEF等心室重構(gòu)指標(biāo)、降低血清NT-proBNP水平，且黃芩苷高劑量組較中、低劑量組改善趨勢(shì)更加明顯。證實(shí)小劑量黃芩苷即可通過抑制病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡，保持有效工作心肌細(xì)胞數(shù)量，達(dá)到逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的作用，進(jìn)而緩解病毒性心肌炎小鼠的心力衰竭狀態(tài)，改善其心臟功能，而黃芩苷灌胃在安全劑量?jī)?nèi)，隨劑量的增加保護(hù)作用愈加明顯。

線粒體是細(xì)胞能量產(chǎn)生的最重要細(xì)胞器，許多因素可以介導(dǎo)線粒體功能障礙，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中，線粒體損傷途徑(內(nèi)源性途徑)是細(xì)胞凋亡的經(jīng)典通路之一[12]。Bielaszewska等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞凋亡過程中，線粒體膜通透性發(fā)生改變，線粒體基質(zhì)滲透壓升高，引發(fā)線粒體膜電位下降的同時(shí)，促使線粒體膜間隙的Cyt C等凋亡誘導(dǎo)因子釋放，觸發(fā)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡[14]。為了探索黃芩苷減少病毒心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠心室肌細(xì)胞線粒體膜電位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒性心肌炎組小鼠心室肌細(xì)胞線粒體膜電位降低，說明CVB3對(duì)小鼠心肌損傷過程中線粒體功能障礙與凋亡密切相關(guān)。而黃芩苷低、中、高劑量組小鼠心室肌細(xì)胞線粒體膜電位有所改善，其中黃芩苷高劑量組改善最明顯。說明黃芩苷減少病毒性心肌炎小鼠心室肌細(xì)胞凋亡可能與減輕線粒體損傷有關(guān)，且隨著黃芩苷劑量的增加，保護(hù)線粒體效果更佳明顯。

線粒體損傷發(fā)生后會(huì)釋放Cyt C到胞質(zhì)中，與多聚化的Apaf-1結(jié)合，再與輔因子ATP結(jié)合，形成復(fù)合體，共同激活Caspase-9形成凋亡體，開啟瀑布效應(yīng)激活Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。為了探求黃芩苷改善病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡的深層機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)對(duì)線粒體Cyt C/Caspase-9/Caspase-3凋亡信號(hào)通路的蛋白表達(dá)與活性進(jìn)行檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，病毒性心肌炎組小鼠心室肌細(xì)胞Cyt C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)增加，Caspase-9、Caspase-3活性增強(qiáng)；黃芩苷低、中、高劑量組小鼠心室肌細(xì)胞Cyt C/Caspase-9/Caspase-3信號(hào)通路激活被抑制，Caspase-9、Caspase-3活性降低，其中黃芩苷高劑量組比低、中劑量組抑制趨勢(shì)更加明顯，說明黃芩苷在保護(hù)病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞線粒的同時(shí)，抑制了Cyt C /Caspase-9 /Caspase-3凋亡信號(hào)通路被激活，且呈劑量依賴性，這可能是黃芩苷抑制病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡、改善心功能的作用機(jī)制之一。這雖然可說明黃芩苷治療病毒性心肌炎的部分作用靶點(diǎn)，但不排除黃芩苷在抑制線粒體凋亡信號(hào)通路的同時(shí)，對(duì)其他凋亡信號(hào)通路也具有抑制作用。

綜上所述，黃芩苷灌胃可抑制病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與升高病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位，緩解線粒體損傷，抑制Cyt C/Caspase-9/Caspase-3凋亡信號(hào)通路表達(dá)與活化有關(guān)。