去鐵胺預處理聯合七氟醚后處理對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

糖尿病是心血管疾病的重要危險因素，合并糖尿病的缺血性心臟病患者圍術期發生心肌缺血再灌注(I/R)損傷的比例是非糖尿病缺血性心臟病患者的2～3倍[1]，有效降低圍術期糖尿病患者I/R損傷極為重要。七氟醚是一種廣泛應用于臨床和基礎實驗的吸入麻醉劑。七氟醚后處理(SPostC)可以發揮與缺血預處理類似的心肌保護作用，并且對年輕和健康心肌發生的I/R損傷具有良好的保護效果[2-3]。在糖尿病狀態下，SPostC的保護作用弱化[4]，但具體機制尚未明確。我們前期研究發現缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)在SPostC減輕健康心肌 I/R 損傷中發揮重要作用[5]。在糖尿病狀態下，HIF-1α受損[6-7]，HIF-1α可能是導致SPostC心肌保護作用弱化的關鍵。本文旨在觀察去鐵胺預處理聯合SPostC對糖尿病大鼠心肌I/R損傷的影響，探討通過激活糖尿病狀態下受損的HIF-1α恢復SPostC的心肌保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 離體心臟模型的制備

常州卡文斯實驗動物有限公司提供清潔級健康雄性糖尿病GK大鼠75只，體質量300～350 g，周齡為14～16周，實驗動物生產許可證號：SCXK(蘇)2016-0010。參照參考文獻[5]建立Langendorff模型：大鼠腹腔注射250 U/kg肝素抗凝和40 mg/kg 1%戊巴比妥鈉麻醉后，固定在鼠板。迅速開胸暴露心臟及心底部大血管，剪下心臟，保留合適長度的主動脈(3～4 mm)，立即放入預冷的4 ℃ K-H液(NaCl 118 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L、KH2PO31.2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、葡萄糖11 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L，pH值7.45)中使心腔的血液排空。用眼科鑷夾住主動脈兩側，4號手術線將心臟固定于灌注針上，用95%O2、5%CO2預先平衡過的37 ℃ K-H液行主動脈逆行灌注，剪開肺動脈及左心耳，通過二尖瓣口將自制橡膠球囊沿左心耳插入左心室，并連接Powerlab/8SP生物功能實驗壓力傳感器系統。維持60～70 mmHg的灌注壓，調整氣囊大小和位置，并將左室舒張末期壓力(LVEDP)維持在0～10 mmHg。上述步驟應在2 min內完成。離體心臟平衡20 min后，如心率>250次/min，左室發展壓(LVDP)>80 mmHg、室性早搏<2次/min，則提示建模成功。

1.2 實驗分組

將75只糖尿病大鼠隨機分為5組(n=15)。對照組心臟持續灌注K-H液180 min。缺血再灌注組(I/R組)心臟平衡20 min后，灌注4 ℃ Thomas心臟停搏液使心臟停跳，32 ℃下心臟停跳40 min后(無灌注K-H液)，復溫至37 ℃后再灌注K-H液復跳120 min。SPostC組心臟平衡20 min后，灌注4 ℃ Thomas心臟停搏液使心臟停跳，32 ℃下缺血40 min后，再灌注2.4%七氟醚(日本丸石制藥株式會社)飽和的K-H液15 min，后續灌正常K-H液105 min。去鐵胺預處理組(DFO組)心臟缺血前24 h大鼠腹腔給予200 mg/kg去鐵胺(瑞士諾華制藥有限公司)，其余同I/R組。去鐵胺預處理+SPostC組(DFO+SPostC組)心臟缺血前24 h大鼠腹腔給予200 mg/kg去鐵胺，其余同SPostC組。

1.3 血流動力學指標檢測

各組再灌注結束時，通過Powerlab/8SP數據采集系統記錄心率、LVDP、LVEDP以及左室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)等指標。

1.4 透射電鏡觀察心肌超微結構

再灌注2 h后，從每組中隨機取4個心臟，每個心臟取1 mm×1 mm×1 mm左室心肌，經過固定、沖洗、脫水、包埋、切片、染色后，H-600型透射電鏡(×10 000，日本Hitachi公司)觀察心肌細胞線粒體超微結構。

1.5 TTC染色法測定心肌梗死面積

再灌注2 h后，從每組中隨機取5個心臟，置于-80℃冰箱中冷凍7 min，將整個心臟從心尖到心臟底部進行切片，切成厚度大致相同的5片。將心臟切片置于37 ℃、1% TTC溶液中染色20 min，10%福爾馬林固定24 h后進行數碼照相。心肌梗死面積采用Image-Pro Plus 6.0軟件計算。

1.6 Western blot分析

再灌注2 h后，從每組中隨機取6個心臟，通過組織裂解液提取心肌組織總蛋白。取蛋白樣品30 μg，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，轉膜，于37 ℃封閉2 h，分別加入小鼠抗大鼠HIF-1α單克隆抗體(1∶1 000，美國Sigma公司)、小鼠抗大鼠血管內皮生長因子(VEGF)單克隆抗體(1∶1 000，美國Sigma公司)和山羊抗鼠GAPDH多克隆抗體(1∶1 000，美國Sigma公司)，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗兔抗鼠IgG-HRP和兔抗山羊IgG-HRP(美國Sigma公司)室溫孵育1 h。ECL顯色成像，應用Quantity One圖像分析系統對目的蛋白條帶進行灰度值分析。

1.7 統計學分析

采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差表示。組間比較采用單因素方差分析，Newman-Keuls法進行顯著性檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血流動力學指標比較

與對照組相比，I/R組、SPostC組、DFO組、DFO+SPostC組心率、LVDP、+dp/dtmax均明顯降低，LVEDP明顯增加(P均<0.05)；與I/R組相比，DFO組、DFO+SPostC組LVEDP明顯降低，且心率、LVDP、+dp/dtmax明顯改善(P均<0.05)；與DFO組相比，DFO+SPostC組LVEDP明顯降低，且心率、LVDP、+dp/dtmax明顯改善(P均<0.05)。見表1。

表1 各組血流動力學指標比較

2.2 心肌線粒體超微結構比較

電鏡下觀察，對照組線粒體結構完整，排列整齊；I/R組肌絲溶解甚至斷裂，線粒體腫脹，嵴膜間隙變寬、破裂，肌漿網高度擴張；SPostC組線粒體與I/R組無明顯區別；DFO組線粒體結構完整度略優于I/R組，但線粒體仍顯腫脹，排列紊亂，肌絲部分溶解；DFO+SPostC組較DFO組明顯改善，線粒體形態基本完整，排列整齊，但仍略有腫脹。見圖1。

2.3 心肌梗死面積比較

與對照組相比，SPostC組梗死面積明顯增加[(37.2±3.77)%對(2.84±0.93)%，P<0.05]。與I/R組[(38.8±2.28)%]相比，DFO組[(29.2±3.11)%]和DFO+SPostC組[(21.4±4.16)%]的梗死面積均明顯減少(P均<0.05)；DFO+SPostC組與DFO組相比，心肌梗死面積明顯減少(P<0.05)。見圖2。

圖2 TTC染色檢測各組心肌梗死情況

2.4 HIF-1α、VEGF蛋白表達水平比較

與對照組相比，SPostC組HIF-1α、VEGF蛋白表達水平均明顯增加(P均<0.05)；與I/R組相比，DFO組、DFO+SPostC組HIF-1α、VEGF蛋白表達水平均明顯增加(P均<0.05)；DFO+SPostC組HIF-1α、VEGF蛋白表達水平與較DFO組明顯增加(P<0.05)，見圖3、表2。

圖3 Western blot法檢測各組HIF-1α、VEGF蛋白表達情況

表 2 各組HIF-1α、VEGF蛋白表達水平比較

3 討論

本研究中，Langendofff體外灌注模型消除了體液和神經因素的影響，有助于觀察藥物對心臟的直接影響。本研究結果表明，遭受I/R損傷后，糖尿病大鼠心肌線粒體結構明顯受損，提示離體心臟I/R損傷模型制備成功。SPostC組各指標與I/R組并無明顯差異，這與Drenger的研究結論一致[4]，說明糖尿病心肌發生 I/R 損傷時的心肌保護作用被弱化。

研究表明，在低氧條件下，HIF-1α是通過調控VEGF、促紅細胞生成素(EPO)等下游靶基因的表達促使細胞生存的關鍵因子[8]，也是觸發心肌內源性保護機制的樞紐。我們前期研究發現，HIF-1α是介導SPostC對抗缺血心肌損傷的內源性關鍵靶點。為了證實在糖尿病狀態下，這一靶點受損可能是導致SPostC保護作用弱化的根源，本研究觀察去鐵胺預處理聯合SPostC對糖尿病大鼠心肌I/R損傷的影響，發現DFO組心功能明顯改善，心肌超微結構明顯優于I/R組，心肌梗死面積也明顯減少，而DFO+SPostC組各指標優于DFO組，提示去鐵胺具有減輕糖尿病大鼠心肌I/R損傷的作用，并且能夠恢復糖尿病狀態下SPostC的心肌保護作用。

去鐵胺是美國食品和藥品管理局(FDA)批準的一種高選擇性鐵螯合劑，臨床使用已近半個世紀。去鐵胺不僅能阻斷芬頓反應，還能抑制脯氨酰羥化酶，從而激活某些缺氧誘導轉錄因子，使細胞適應缺氧的環境。研究表明，無論全身還是局部應用去鐵胺都能穩定并激活HIF-1α，上調其下游靶基因，促進糖尿病患者傷口的愈合[9]。本研究結果表明，I/R組HIF-1α表達并沒有增加，這與Marfella等[10]的研究結論一致，說明在糖尿病狀態下HIF-1α受損，即使缺氧也不能有效激活HIF-1α，使其發揮內源性保護作用。而DFO組與DFO+SPostC組的HIF-1α蛋白表達明顯升高，并且心肌梗死面積減少，這與Luciano等[11]的研究結論一致。說明HIF-1α可能是糖尿病狀態下SPostC保護效果弱化的關鍵，去鐵胺預處理能夠激活糖尿病狀態下受損的HIF-1α，去鐵胺聯合SPostC能夠激活并上調糖尿病狀態下受損的HIF-1α，從而發揮心肌保護作用。

VEGF是最重要的血管生成細胞因子，也是HIF-1α的下游靶基因，在缺氧性疾病的血管新生過程中扮演關鍵角色[12]。VEGF 作用于靶細胞-血管內皮細胞，具有一定的特異性，可通過促進內皮細胞進行有絲分裂及增殖，促進組織新生血管形成[13]。在心肌發生缺血時，VEGF表達增加[14]，可以通過囊泡小體介導的跨膜途徑，引起血漿蛋白外滲，導致細胞外環境發生變化，提高血管的通透性[15]。研究發現，在非糖尿病狀態下，七氟醚能夠上調VEGF的表達，一方面能夠促進血管重構和內皮化，另一方面還發揮抗炎作用[12]。本研究發現DFO+SPostC組與DFO組相比，VEGF表達水平明顯增加，線粒體結構損傷程度較輕，心肌梗死面積明顯減少，這提示去鐵胺聯合SPostC可能通過激活并促進糖尿病狀態下HIF-1α的表達，上調下游靶基因VEGF的表達，最終減少心肌梗死面積，減輕缺血心肌的損傷。

綜上所述，去鐵胺預處理聯合SPostC可以激活并促進 HIF-1α高表達，上調VEGF 的表達，增加缺血心肌的微血管密度，提高血管通透性，減少糖尿病大鼠的心肌梗死面積并改善心功能。本研究揭示了病理性心肌應用SPostC心肌保護作用弱化的分子機制，也為圍術期應用SPostC實施病理性心肌保護提供了科學依據。