白藜蘆醇對阿霉素誘導心肌細胞凋亡的保護作用及機制研究

阿霉素是一種廣泛應用于治療實體腫瘤和血液系統腫瘤的細胞毒藥物，該藥物的心臟毒性限制了其應用[1]。研究表明，阿霉素的心臟毒性與化療周期中阿霉素的總累積劑量相關，長期高劑量使用可導致嚴重且不可逆的退行性心肌病和充血性心力衰竭[2-4]。阿霉素引起心臟不良反應的機制尚未完全明確，可能涉及多種途徑，包括氧自由基生成、過氧亞硝酸鹽形成、鈣超載、線粒體功能障礙、細胞凋亡及自噬等[5-6]。

E2F轉錄因子1(E2F1)通過影響細胞周期，在癌癥進展中發揮重要作用[7]。研究表明，E2F1調節腺苷酸活化蛋白激酶α2(AMPKα2)，參與阿霉素誘導的心臟毒性[8-9]。白藜蘆醇(RSV)是一種天然的植物抗毒素，可以通過減少氧化應激、抑制細胞凋亡和調節自噬過程，部分逆轉阿霉素的心臟毒性[11-13]。本研究擬通過建立細胞模型，探討RSV對阿霉素誘導的心肌細胞凋亡的調控作用，以及E2F1/AMPKα2信號通路在其中發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

大鼠心肌細胞系(H9c2)購自美國組織培養中心(ATCC)，采用含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基培養細胞。用無血清培養基沖洗細胞后，將細胞予以不同時間梯度的1 μmol/L阿霉素處理。細胞處理后，取96孔板，每孔加入細胞懸液100 μL，細胞濃度為2×105個/mL，加入5 g/L MTT溶液20 μL，于37 ℃反應4 h。加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度值。

1.2 細胞轉染

待H9c2細胞生長至70%融合度時，根據Lipofectamine Plus(Invitrogen公司)說明書，采用終濃度為40 nmol/L的E2F1的小干擾RNA siE2F1轉染H9c2細胞(siE2F1轉染組)，靶序列為5′-CCUGGAGCAUGUUAAAGAAUU-3′。siRNA陰性對照組轉染終濃度為40 nmol/L的siRNA陰性對照，空白對照組加入等量生理鹽水培養，轉染6 h后更換為完全培養基繼續培養48 h，收集細胞檢測E2F1的表達水平。實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測E2F1轉染效率，Trizol法提取細胞總RNA，以反轉錄試劑盒(TOYOBO公司)將總RNA反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。擴增條件：95 ℃，10 min解鏈；隨后95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。內參GAPDH引物序列：上游引物5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′，下游引物5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′。E2F1引物序列：上游引物5′-GCAACGCCGCAGGCG CCC-3′，下游引物5′-GAGTTGGATGCCCTCCA GG-3′。采用 2-ΔΔCt法計算E2F1 mRNA的相對表達量。

1.3 實驗分組

將H9c2細胞分為6組：對照組、阿霉素組、 siE2F1組、阿霉素+siE2F1組、RSV組、阿霉素+RSV組。阿霉素組加入終濃度為1 μmol/L的阿霉素，siE2F1組在siE2F1轉染細胞中加入等量的生理鹽水，阿霉素+siE2F1組為siE2F1轉染細胞，加入終濃度為1 μmol/L的阿霉素，RSV組加入終濃度為20 μmol/L的RSV，阿霉素+RSV組同時加入終濃度為1 μmol/L的阿霉素和20 μmol/L的RSV，對照組加入等量的生理鹽水，干預24 h后收獲細胞。

1.4 細胞凋亡檢測

按照凋亡檢測試劑盒(BD Pharmingen公司)使用說明書，采用Annexin V-FITC和PI各5 μL對細胞進行雙染色。室溫避光孵育15 min后，流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達水平

采用RIPA細胞裂解液提取細胞蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對蛋白(20 μg)進行分離，轉移到硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h，E2F1兔多克隆抗體(1∶1 000，Sigma-Aldrich公司)、AMPKα2兔單克隆抗體(1∶1 000，Sigma-Aldrich公司)、胱天蛋白酶-3(caspase-3)兔多克隆抗體(1∶1 000，Cell Signaling Technology公司)、GAPDH兔多克隆抗體(1∶1 000，Sigma-Aldrich公司)4 ℃孵育過夜，山羊抗兔二抗(1∶5 000)常溫孵育1 h。滴加ECL化學發光劑，化學發光成像系統(Bio-rad公司)顯影，并用ImageJ軟件對條帶灰度值進行分析。

1.6 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計學分析。連續變量以均數±標準差表示，兩個獨立樣本間比較用t檢驗，多個獨立樣本間比較采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 阿霉素降低心肌細胞活力

阿霉素損傷可顯著降低心肌細胞活力，并呈時間依賴性(阿霉素不同處理時間與0 h相比，P均<0.05)，當處理時間為24 h時，細胞活力下降約50%，損傷程度適宜，以該濃度進行后續實驗。

2.2 siE2F1轉染抑制E2F1表達

轉染48 h后，siE2F1轉染組E2F1 mRNA和蛋白的表達水平與siRNA 陰性對照組和空白對照組相比均顯著降低(P均<0.001)，見表1。

表1 轉染后各組E2F1 mRNA和蛋白表達水平比較

2.3 阿霉素通過上調E2F1誘導心肌細胞凋亡

采用Annexin V/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡，與對照組相比，阿霉素組H9c2心肌細胞凋亡率顯著升高，siE2F1組凋亡率顯著降低，阿霉素+siE2F1組凋亡率顯著升高(P均<0.05)。與阿霉素組相比，阿霉素+siE2F1組凋亡率顯著降低(P<0.001)。見圖1A、表2。

采用Western blot法檢測細胞內蛋白水平，與對照組相比，阿霉素組E2F1、AMPKα2和caspase-3剪切體(cleaved caspase-3)的蛋白表達水平顯著升高(P均<0.001)；siE2F1組E2F1、AMPKα2的蛋白表達水平顯著降低(P均<0.001)，cleaved caspase-3的蛋白表達水平無統計學差異；阿霉素+siE2F1組E2F1、AMPKα2的蛋白表達水平顯著降低，cleaved caspase-3的蛋白表達水平顯著升高(P均<0.001)。但與阿霉素組相比，阿霉素+siE2F1組E2F1、AMPKα2和cleaved caspase-3的蛋白表達水平均顯著降低(P均<0.001)。見圖1B、表2。

2.3 RSV通過抑制E2F1部分逆轉阿霉素介導的心肌細胞凋亡

Annexin V/PI雙染流式細胞術檢測顯示，RSV組細胞凋亡率與對照組、阿霉素組相比顯著降低(P均<0.05)；阿霉素+RSV組細胞凋亡率雖高于對照組，但顯著低于阿霉素組(P均<0.001)。見圖2A、表3。

注：A為Annexin V/PI雙染色法檢測各組心肌細胞凋亡水平；B為Western blot法檢測各組心肌細胞蛋白表達情況

表2 siE2F1轉染后各組H9c2心肌細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達水平的比較

RSV組E2F1、AMPKα2和cleaved caspase-3的蛋白表達水平與對照組、阿霉素組相比顯著降低(P均<0.05)。阿霉素+RSV組E2F1、AMPKα2和cleaved caspase-3的蛋白表達水平雖高于對照組，但與阿霉素組相比顯著降低(P均<0.001)。見圖2B、表3。

注：A為Annexin V/PI雙染色法檢測各組心肌細胞凋亡水平；B為Western blot法檢測各組心肌細胞蛋白表達情況

表3 RSV干預后各組H9c2心肌細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達水平的比較

3 討論

阿霉素屬蒽環類抗腫瘤藥物，廣泛應用于實體腫瘤和血液系統腫瘤的治療[14]。阿霉素在發揮抗腫瘤作用的同時，可對正常細胞產生毒性，由于其容易在心肌細胞中積累，故有明顯的心臟毒性[2-4,15]。本研究結果提示阿霉素能夠降低心肌細胞的活力，促使心肌細胞發生凋亡。

我們既往的研究證明阿霉素誘導的心臟毒性與p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)/p53和AMPK/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/自噬相關蛋白1(Ulk1)的信號通路有關[11-12,16]。但有關阿霉素對AMPK活化作用的研究得出了不同結論[9,17-19]。AMPK可能有具有雙重作用的亞型，即具有維持細胞存活特性的亞型(AMPKα1)和誘導細胞凋亡的亞型(AMPKα2)[9]。另外，E2F1可通過轉錄激活G1/S轉換和調節有絲分裂的相關基因，使細胞進行不可逆的DNA復制，在癌癥進展中發揮重要作用[7]。隨后的研究表明，與增殖和惡性轉化相關的其他生物過程也受E2F1調節，包括細胞生長、自噬、侵襲和轉移[20-21]。E2F1還可通過激活AMPKα2，參與阿霉素誘導的心臟毒性過程[9]。本研究結果顯示，在H9c2心肌細胞中，阿霉素可誘導E2F1和AMPKα2的激活，抑制E2F1可減輕阿霉素誘導的AMPKα2的激活和細胞凋亡過程。

RSV是一種在葡萄中大量存在的多酚化合物，具有抗氧化、抗炎和抗癌特性[10]。RSV的心臟保護作用與減少氧化應激、抑制細胞凋亡和調節自噬等相關[11-12]。研究表明，RSV可減少過氧化氫誘導的心肌細胞氧化應激，從而在糖尿病心肌病大鼠模型中發揮心臟保護作用[13,22]。RSV還可通過抑制Bax和caspase-3的活化，抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡[23-25]。既往的研究表明，RSV與阿霉素聯合使用可以預防阿霉素的心臟毒性，并在體內和體外協同抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[11-12,16]。RSV能夠通過下調E2F1和抑制磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸激酶(p-AKT)，增加鼻咽癌(NPC)細胞對放射的敏感性，促進NPC凋亡[26]。本研究發現，RSV可部分逆轉阿霉素引起的H9c2心肌細胞凋亡，抑制E2F1和AMPKα2的激活，提示RSV對阿霉素所致心肌細胞凋亡的保護作用可能是通過調控E2F1/AMPKα2信號通路實現的。