配對相關的同源異型框1導入棕色脂肪干細胞構建生物起搏

生物起搏是通過誘導類竇房結樣細胞的產生，構建類似于竇房結的起搏位點以替代原受損的起搏細胞，使病態竇房結綜合征患者獲得正常生理活動所需的起搏心率。在心血管胚胎發育期間，心臟搏動位點首先位于左側，后逐漸轉移至右側，左側的搏動位點消失，Nodal-Pitx2信號通路在心臟左側的偏側性表達過程中發揮了不可替代的作用[1]。研究證明，在斑馬魚的胚胎發育期，配對相關的同源異型框(prrx)1在心臟右側循環發育過程中發揮重要作用，其在右側靜脈竇角的表達明顯高于左側，Prrx1敲除后右側靜脈竇發育不全，心房體積小，但動脈極未受明顯影響，并且Prrx1在心臟后極與胰島素基因增強子結合蛋白1(ISL-1)共表達，Prrx1敲除后無法檢測到胚胎竇房結重要標志物TBX18和ISL-1的表達[2]。本研究旨在探討Prrx1與竇房結發育相關轉錄因子的關系，闡述Prrx1在生物起搏中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.2 大鼠棕色脂肪干細胞(BADSC)的原代培養及鑒定

將SD大鼠脫頸處死，75%乙醇浸泡10 min，無菌條件下取大鼠肩胛間區皮下脂肪組織置于培養皿中， PBS清洗后剪碎，加入Ⅰ型膠原酶，37 ℃振蕩消化60 min，1 500 r/min離心10 min，除去上層脂肪及上清，收集所得的細胞沉淀物，加入含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養。

培養48 h后換液，PBS沖洗后加入含10%FBS的DMEM培養液。以后每48 h換液1次，細胞融合至80%時傳代，傳至第3代備用。

在顯微鏡下觀察原代及傳代細胞形態變化。取第3代細胞，常規胰酶消化成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×106個/mL，加入CD90、CD45單克隆抗體，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞表面抗原陽性率。

1.3 Prrx1-GFP腺病毒的構建和轉染

采用 AdMax 腺病毒包裝系統進行腺病毒包裝，將攜帶Prrx1的腺病毒穿梭質粒與不攜帶腺病毒大部分基因組(E1/E3 缺失)的輔助包裝質粒共轉染 HEK293 細胞，酶切產生攜帶Prrx1的非復制型重組腺病毒，PCR擴增Prrx1 ORF序列，將處理好的目的片段與載體連接，得到重組腺病毒質粒pH-BAd-MCMV-GFP-Prrx1。

將BADSC種于24孔板內，調整細胞計數后根據感染復數(MOI)值0、10、20、50、100、200分別加入帶有GFP和帶有Prrx1基因的腺病毒，以不引起明顯細胞病變的最大MOI值作為最適宜MOI。將BADSC接種于6孔板，隨機分為Ad-GFP組和Ad-Prrx1組。Ad-Prrx1組轉染Prrx1腺病毒(Ad-Prrx1-GFP)，Ad-GFP組轉染Ad-GFP作為對照。熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄培養24 h、48 h后的細胞形態。

1.4 免疫熒光檢測

細胞轉染病毒7 d后，4%多聚甲醛冰上固定10～15 min，分別加入HCN4、TBX18或ISL-1一抗4 ℃孵育過夜，熒光二抗室溫孵育1 h，采用DAPI染核10 min后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.5 qRT-PCR檢測

采用qRT-PCR檢測病毒轉染7 d后細胞TBX18、ISL-1、Pitx2及HCN4 mRNA的表達水平，β-Actin為內參。采用Trizol試劑提取總RNA，分光光度計測定RNA的濃度。cDNA的合成體系：5×Reaction Buffer 2.0 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，Oligo dT 1.0 μL，RNase Inhibitor 1.0 μL，總RNA 13 μL (2 μg)，逆轉錄酶0.5 μL；37 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min。使用SYBR Green Ⅰ PCR試劑盒進行PCR，引物見表1。每個樣品均作3個復孔，反應條件：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環，用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA的相對表達水平。

表1 qRT-PCR引物信息

1.6 Western blot檢測

病毒轉染7 d后，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳后轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。β-actin(1∶10 000)、ISL-1(1∶500)、TBX18(1∶500)、HCN4(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜，羊抗大鼠HRP(1∶10 000)二抗孵育30 min，化學發光法顯影。各條帶掃描后采用圖像分析系統分析平均灰度值，以β-Actin為內參計算蛋白的相對表達水平。

1.7 膜片鉗If電流的記錄

使用Axopatch 700B放大器以全細胞膜模式記錄起搏電流。BADSC轉染病毒7 d后，記錄細胞If電流。細胞外液的配制(mmol/L)：NaCl 138，KCl 5，CaCl22，葡萄糖10，MgCl20.5，HEPES 10，用NaOH調定pH值至7.4。電極內液的配制(mmol/L)：谷氨酸鉀 130，KCl 9，NaCl 8，MgCl20.5，HEPES 10，EGTA 2，Mg-ATP 5，用NaOH調定pH值至7.2。If電流的刺激程序：鉗制電壓-35 mV，再以-10 mV為歩階從-35 mV降至-140 mV，時程為2 s。記錄時胞外液加入BaCl24 mmol/L以阻斷超極化激活的內向整流鉀電流(Ik1)，予以2 mmol/L CsCl對記錄到的If電流進行鑒定。采用pCLAMP 6.0.4軟件進行數據的記錄與分析處理。

1.8 統計學分析

通過GrapdhPad Prism 5統計軟件進行數據分析。計量資料均用均數±標準差表示，組間比較采用兩個獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BADSC形態、表型鑒定及病毒轉染

急性分離棕色脂肪組織，培養后48 h首次換液，可見散在單個的BADSC貼壁，呈長梭形。以后每48 h換液，5～7 d后細胞形態較為均一，細胞呈旋渦樣生長，可見集落形成。細胞傳代至3代后，流式細胞儀檢測示細胞CD90陽性率92.8%，CD45陽性率<1.2%，見圖1。腺病毒轉染BADSC，不引起明顯細胞病變的病毒轉染最適宜MOI值為100，見圖2。轉染的GFP和Prrx1均帶有綠色熒光，轉染48 h后細胞熒光表達強度增強。

注：A、B分別為培養48 h、7 d的BADSC(×100)；C為流式細胞術鑒定BADSC

注：A、B、C、D、E、F中感染復數(MOI)值分別為0、10、20、50、100和200

2.2 過表達Prrx1能增加竇房結相關因子的表達

腺病毒轉染7 d后檢測兩組細胞TBX18、ISL-1、HCN4的mRNA和蛋白表達水平以及Prrx1、Pitx2的mRNA表達水平。與Ad-GFP組相比，Ad-Prrx1組中的Prrx1、TBX18、ISL-1和HCN4的mRNA表達水平明顯升高，而Pitx2的表達水平明顯降低(P均<0.05)。與Ad-GFP組相比，Ad-Prrx1組中的TBX18、ISL-1和HCN4的蛋白表達水平明顯升高(P均<0.05)。見表2、圖3。

表2 兩組竇房結相關因子mRNA和蛋白相對表達水平的比較

圖 3 兩組TBX18、ISL-1及HCN4的蛋白表達水平

2.3 Prrx1與TBX18、ISL-1共表達

免疫熒光檢測發現，腺病毒轉染7 d后Ad-Prrx1組可見 HCN4、TBX18、ISL-1與Prrx1在BADSC中共表達，Ad-GFP組未發現上述蛋白共表達。見圖4。

2.4 過表達Prrx1能誘導BADSC產生起搏電流

在倒置熒光顯微鏡下篩選出胞膜較為光滑且同時表達綠色熒光的長梭狀細胞，進行起搏電流檢測，見圖5A。腺病毒轉染7 d后膜片鉗可在Ad-Prrx1組中記錄到If電流，當在細胞外液中加入4 mmol/L的CsCl后，該電流被阻斷，洗脫阻斷劑CsCl后，內向電流可恢復，且該內向電流呈現電壓依賴性，隨著電壓的減小而逐漸減小；而在Ad-GFP組中未記錄到該超極化激活的內向電流，見圖5B、5C。

圖 4 兩組Prrx1與TBX18、ISL-1及HCN4的共表達情況

3 討論

近年來構建竇房結起搏樣細胞的方式大致可分為4種：(1)以基因導入為基礎，如通過導入各種編碼離子通道的基因，抑制KCNJ2基因[編碼內向整流鉀離子通道(Ik1)][3]或超極化激活環核苷酸門控通道(HCN，編碼If電流)[4]。(2)通過干細胞移植誘導人類胚胎干細胞向竇房結樣細胞分化[5]。(3)融合細胞-基因的方法，如將T-box家族中轉錄因子TBX18導入多能干細胞(iPSC)中，誘導出類竇房結細胞[6]。(4)體細胞重編程，如直接構建帶有TBX18的病毒，將其注入成年豬的心室肌細胞[7]，誘導形態和功能與結樣細胞相似的細胞。

注：A為倒置熒光鏡下轉染腺病毒后用于膜片鉗記錄的BADSC(×200)；B為起搏電流If的電壓-電流曲線(n=8)；C上圖為Prrx1組所記錄到的內向電流，下圖為CsCl阻斷后的電流

生物起搏器的研發可以借鑒竇房結的胚胎發育過程。 TBX18和ISL-1作為竇房結早期發育的標志蛋白，在竇房結的胚胎發育期間高表達。研究表明，TBX18和ISL-1單獨作用于心肌細胞或者干細胞能誘導出類竇房結細胞，從而構建生物起搏[8-9]。現已發現的參與竇房結胚胎期發育的因子主要包括：TBX18、TBX3[10]、shox2[11-12]、ISl-1[13]、Nkx2.5[14]等轉錄因子，HCN4[15]、L型鈣通道、鈉鈣交換體等離子通道，細胞表面黏附分子CD166[16]，縫隙連接蛋白Cx45、Cx43等。

Prrx1與shox2為同源基因，兩者在胚胎期骨骼和心血管的發育中起重要作用。Bergwerff等[17]研究發現Prrx1存在于間質，參與細胞基質的分化，在胚胎中表達于中胚層和神經嵴，敲除Prrx1可導致動脈導管錯位、主動脈弓不能正常彎曲、右側鎖骨下動脈向后異常傾斜等血管異常。此外，Prrx1還可促進血管平滑肌細胞擴增，與Prrx2一起調控肺血管病[18]。在成人中，Prrx1突變可引起心房顫動，Prrx1突變還可影響心臟的動作電位時程，從而增加房顫的易感性[19-20]。

Ocana等[2]研究發現Prrx1在胚胎期與TBX18、ISL-1共表達，敲除Prrx1可導致靜脈竇區幾乎不表達TBX18、ISL-1。但Prrx1在竇房結發育過程中的作用尚未明確，本研究發現通過過表達Prrx1能增加BADSC竇房結相關因子TBX18、ISL-1和HCN4的表達，且能在該細胞上記錄到起搏If電流，提示過表達Prrx1能誘導出類竇房結細胞。因此，我們推測Prrx1可能作為上游調節因子，調節TBX18和ISL-1的表達，在生物起搏中發揮作用。此外，過表達Prrx1還能抑制Pitx2的轉錄水平，提示其可能通過抑制Pitx2在心臟右側表達，從而避免Pitx2對右側起搏位點的抑制作用，此結果與Ocana等的研究結果一致，但Prrx1與Pitx2的相互作用仍值得進一步探究。

本研究有一定的局限性，僅發現Prrx1能影響細胞竇房結相關因子的表達，未研究其對心率的影響；僅以BADSC為研究對象，Prrx1對心肌細胞及iPSC的功能影響未能闡明。未來尚需在動物實驗中進一步驗證Prrx1誘導類竇房結細胞的作用。