Crim1過表達(dá)抑制肥大乳鼠心室肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀電流改變

病理性心肌肥大導(dǎo)致的心室重構(gòu)是慢性充血性心力衰竭(CHF)最主要的病理生理機(jī)制[1-2]。心臟性猝死是CHF患者主要的死亡原因[3]。心室肌細(xì)胞離子通道重構(gòu)是導(dǎo)致心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位改變，進(jìn)而引發(fā)惡性室性心律失常的重要病理生理基礎(chǔ)[4-5]。

半胱氨酸豐富跨膜成骨蛋白調(diào)控因子(Crim1)是調(diào)控胚胎組織器官發(fā)育的重要因子，并參與心室肌細(xì)胞及心室組織肥大的調(diào)控[6-7]。Crim1是否參與肥大心肌細(xì)胞離子通道重構(gòu)的調(diào)控目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的肥大乳鼠心室肌細(xì)胞模型中，編碼瞬時(shí)外向鉀電流(Ito)離子通道α亞基的Kv4.2基因和蛋白表達(dá)下調(diào)，心室肌細(xì)胞Ito離子通道失活加快，而致Ito電流密度減小，細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程(APD)延長[8]。本研究旨在探討Crim1過表達(dá)對(duì)肥大心室肌細(xì)胞Ito的調(diào)控作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 主要試劑和儀器

兔抗鼠Crim1抗體(北京博奧森公司)，兔抗鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(Santa Cruz公司)，羊抗兔辣根過氧化物酶-IgG(北京中杉金橋公司)，胰酶和Ⅱ型膠原酶(Sigma公司)。高糖DMEM培養(yǎng)基、特優(yōu)級(jí)胎牛血清(FBS)、苯腎上腺素(PE)、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)均為Gibco公司產(chǎn)品。攜帶Crim1基因的重組腺病毒(Ad-Crim1)、腺病毒空載體(Ad-null)購自上海ThermoFisher SCIENTIFIC公司。Axopatch 700B膜片鉗放大器及Digidata 1322數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器(美國Axon公司)，Sutter p-97微電極拉制儀(美國Sutter公司)，BJ-40玻璃微電極(北京正天易科貿(mào)有限公司)。

記錄鉀電流的細(xì)胞外液(mmol/L)：NaCl 136，HEPES 10.0，KCl 5.4，MgCl2·6H2O 1.0，Glucose·H2O 10.0，NaH2PO40.33，BaCl20.5，CdCl20.3，CaCl2·2H2O 2.0，用NaOH溶液將pH值調(diào)至7.4。電極內(nèi)液(mmol/L)：Na2·ATP 5.0，KCl 140，HEPES 10.0，MgCl2·6H2O 1.0， EGTA 5.0，用KOH溶液將pH值調(diào)至7.2。含鈣臺(tái)氏液(mmol/L)：NaH2PO40.33，NaCl 136，KCl 5.4，葡萄糖 10.0，HEPES 10.0，CaCl2·2H2O 2.0，用NaOH溶液將pH值調(diào)至7.4。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)1 d齡SD大鼠乳鼠，雌雄不限，購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心[許可證號(hào)SYXK(京)2011-0039]。此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過貴州省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(院倫理審查[2012]001號(hào))。

1.3 原代乳鼠心室肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

乙醚氣霧麻醉下處死乳鼠，75%乙醇體表消毒。分離左心室，保留室間隔。剪碎心肌組織，給予終濃度分別為0.1%的胰蛋白酶和0.03%的2型膠原酶混合酶解液分離細(xì)胞。差速貼壁與BrdU結(jié)合處理獲得純化的心肌細(xì)胞[7,9-10]。加入10%FBS-DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后換成無血清DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 重組腺病毒感染原代心室肌細(xì)胞的有效性鑒定

細(xì)胞培養(yǎng)48 h后換成無血清DMEM高糖培養(yǎng)基，分4組，分別給予Ad-null和Ad-Crim1 [分3組，感染復(fù)數(shù)(MOI)分別為25、100、200] 感染原代心室肌細(xì)胞32 h，Western blot檢測(cè)Crim1蛋白表達(dá)，驗(yàn)證Ad-Crim1感染過表達(dá)的有效性，并據(jù)此篩選出合適的病毒感染滴度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞分組干預(yù)

心室肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后更換無血清DMEM高糖培養(yǎng)基，按干預(yù)方式不同分為3組。重組腺病毒空載體(Ad-null)組：Ad-null感染細(xì)胞32 h。重組腺病毒空載體+苯腎上腺素(Ad-null+PE)組：Ad-null感染細(xì)胞8h后，予PE干預(yù)24 h。Crim1過表達(dá)的重組腺病毒+苯腎上腺素(Ad-Crim1+PE)組：Ad-Crim1感染細(xì)胞8 h后，予PE干預(yù)24 h。

1.6 心室肌細(xì)胞結(jié)晶紫染色

結(jié)晶紫行活細(xì)胞染色。每組細(xì)胞在400倍顯微鏡下隨機(jī)拍照10個(gè)視野，ImageJ軟件測(cè)量細(xì)胞表面積，計(jì)算細(xì)胞平均面積。

1.7 Western blot檢測(cè)

提取總蛋白。細(xì)胞蛋白按40 μg上樣量進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)膜后用5 %羊血清37 ℃封閉2 h，加入一抗兔抗鼠Crim1抗體(1∶100)或兔抗GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，再與二抗羊抗兔辣根過氧化物酶-IgG，37 ℃孵育2 h。Bio-Rad化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)。利用ImageJ專業(yè)圖像分析軟件對(duì)發(fā)光條帶進(jìn)行半定量分析，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行校正。每組樣本重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.8 全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)心室肌細(xì)胞Ito

預(yù)溫的0.125%胰酶消化心室肌細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。于直徑35 mm培養(yǎng)皿中調(diào)整細(xì)胞數(shù)約為1×102個(gè)/mL，37℃ 95% CO2培養(yǎng)2～3 h使細(xì)胞貼壁。選擇立體感強(qiáng)，大小適中的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。玻璃微電極充灌電極液后電阻為2～4 MΩ。施加負(fù)壓使電極與細(xì)胞表面形成1 GΩ以上高阻抗封接。破膜，給予慢電容補(bǔ)償，形成全細(xì)胞記錄。設(shè)置鉗制電壓為-80 mV，給予指令電位從-40～+70 mV，躍階電壓10 mV，波寬300 ms，頻率0.2 Hz的刺激，記錄Ito。5 mmol/L的4-氨基吡啶能阻斷該電流，證實(shí)該電流為Ito。為避免因細(xì)胞大小所造成的誤差，采用電流密度分析，電流密度(pA/pF)=電流強(qiáng)度/電容。電流信號(hào)經(jīng)Ag/AgCl電極引導(dǎo)，由膜片鉗AXON 700B放大器放大，通過AD/DA轉(zhuǎn)換板，存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)硬盤中。實(shí)驗(yàn)過程由pCLAMP 10.0軟件程進(jìn)行序刺激發(fā)放和信號(hào)采集。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用pCLAMP 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)和圖形轉(zhuǎn)換，運(yùn)用SigmaPlot軟件繪制離子通道電流密度-電壓曲線。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，多組間兩兩比較方差齊性時(shí)用LSD檢驗(yàn)，方差不齊性時(shí)用Dunnett T3檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ad-Crim1感染心室肌細(xì)胞促Crim1蛋白表達(dá)

為證實(shí)Ad-Crim1感染原代心室肌細(xì)胞促Crim1蛋白表達(dá)的有效性，分別用Ad-Crim1或者Ad-null感染原代心室肌細(xì)胞32 h。當(dāng)Ad-Crim1滴度為分別MOI 25、100及200時(shí)，Ad-Crim1 3組心室肌細(xì)胞Crim1蛋白相對(duì)表達(dá)水平均較Ad-null組(Ad-null組為1)明顯升高，分別為1.83±0.13、2.51±0.12和2.82±0.27(P均<0.05)，說明Ad-Crim1感染原代心室肌細(xì)胞促Crim1蛋白表達(dá)有效。Ad-Crim1 3組中MOI 25組Crim1蛋白表達(dá)水平較MOI 100組和MOI 200組低，而MOI 100組和MOI 200組表達(dá)水平相近。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取Ad-Crim1感染心室肌細(xì)胞的病毒滴度為MOI=100。見圖1。

圖1 腺病毒感染培養(yǎng)的心室肌細(xì)胞促Crim1蛋白表達(dá)

2.2 過表達(dá)Crim1抑制PE誘導(dǎo)的心室肌細(xì)胞肥大

結(jié)晶紫染色顯示Ad-null組、Ad-null+PE組和Ad-Crim1+PE組心室肌細(xì)胞大小有差異，見圖2。ImageJ軟件測(cè)量Ad-null組、Ad-null+PE組和Ad-Crim1+PE組心室肌細(xì)胞面積分別為(279.76±73.71)μm2、(568.29±84.37)μm2和(396.82±45.64)μm2。PE干預(yù)24 h誘導(dǎo)心室肌細(xì)胞面積明顯增大，該效應(yīng)可被過表達(dá)Crim1抑制(P均<0.001)。

注：A為Ad-null組；B為Ad-null+PE組；C為Ad-Crim1+PE組

2.3 過表達(dá)Crim1抑制PE誘導(dǎo)的心室肌細(xì)胞Ito改變

在刺激電壓為20～70 mV時(shí)，Ad-null+PE組細(xì)胞Ito電流密度較Ad-null組明顯減小，而Ad-Crim1+PE組較Ad-null+PE組明顯增大(P<0.05)，見圖3、表1。

3 討論

Crim1是Ⅰ型跨膜蛋白，在胎兒生長發(fā)育過程中的多個(gè)組織器官表達(dá)，調(diào)控胚胎發(fā)育，包括心臟的發(fā)育調(diào)控[11-15]。Crim1對(duì)于胚胎期心臟發(fā)育的影響提示其可能參與出生后心肌肥大的病理生理過程，然而，相關(guān)證據(jù)極少。在培養(yǎng)的牽張刺激肥大乳鼠心室肌細(xì)胞和在體腹主動(dòng)脈結(jié)扎肥大大鼠心室肌組織模型中發(fā)現(xiàn)，Crim1基因和蛋白表達(dá)皆明顯下調(diào)；給予氯沙坦或替米沙坦干預(yù)能顯著減輕心室肌細(xì)胞肥大和心室肥大，同時(shí)上調(diào)Crim1基因和蛋白的表達(dá)，提示Crim1可能參與對(duì)此模型心室肌細(xì)胞及心室組織肥大的調(diào)控，且Crim1表達(dá)對(duì)病理性心肌肥大為負(fù)性調(diào)節(jié)作用[6-7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，給予腎上腺素能α受體激動(dòng)劑PE干預(yù)培養(yǎng)的乳鼠心室肌細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞肥大、細(xì)胞Ito電流密度減小；通過重組腺病毒感染心室肌細(xì)胞獲得Crim1蛋白過表達(dá)干預(yù)，可明顯抑制PE誘導(dǎo)的上述效應(yīng)，證明Crim1參與心室肌細(xì)胞肥大的調(diào)控，并證實(shí)Crim1參與肥大心室肌細(xì)胞離子通道重構(gòu)的調(diào)控。

圖 3 心室肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀電流電流的密度

表1 各組不同電壓下的瞬時(shí)外向鉀電流的電流密度比較 (pA/pF，n=10)

Ito是一種快速激活和快速失活的外向鉀電流，主要參與動(dòng)作電位的1期，與心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的形狀和時(shí)程有關(guān)。Ito減小可延緩動(dòng)作電位1期復(fù)極化，減小1期切跡深度，從而影響其他離子通道活性。在器質(zhì)性心臟病的肥大心室肌中，尤其是合并心力衰竭、心肌損傷時(shí)，心室肌細(xì)胞編碼Ito離子通道的Kv4.3基因及其蛋白表達(dá)皆下調(diào)，Ito離子通道功能活性減低，導(dǎo)致早期復(fù)極異常、復(fù)極延遲和APD延長，易發(fā)生致命性室性心律失常[16-18]。

本研究結(jié)果顯示，Crim1過表達(dá)對(duì)心室肌細(xì)胞肥大及伴隨的Ito電流密度改變有抑制作用，針對(duì)Crim1的干預(yù)，有可能對(duì)心室肥大及伴隨的室性心律失常具有防治作用。