甲狀旁腺激素相關肽改善小鼠心肌梗死后心臟功能的研究

甲狀旁腺激素相關肽(PTHrP)產生于哺乳動物的多種細胞類型，并通過自分泌、旁分泌及內分泌等形式調節細胞增殖、分化和凋亡[1-2]。外源性PTHrP具有擴張動脈的作用，可增加局部心肌血流量，在離體大鼠心臟中，PTHrP具有正性變時變力作用[3]。PTHrP可誘導人成骨細胞(hOB)和人骨肉瘤MG-63細胞分泌血管內皮生長因子(VEGF)[4-5]，同時還是與骨血管新生密切相關的溶骨因子，但PTHrP對心臟的作用，特別是對心肌梗死的作用仍不明確。

PTHrP在各種類型的血管平滑肌細胞(VSMC)中均有表達，當動脈受損或者發生粥樣硬化時，其表達水平會顯著上調[6]。研究表明，PTHrP的核定位序列(NLS)和C末端可抑制基因p27表達，調節VSMC增殖、遷移和凋亡，促進血管內膜新生[7]，因此NLS和C末端兩者共同組成的PTHrP(87-139)片段對于缺血性心臟病可能具有潛在的價值。本研究旨在探討PTHrP(87-139)對心肌梗死后心臟功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

33只體質量約為25 g的6～8周C57BL/6野生型雄性小鼠，由南京醫科大學骨與干細胞實驗中心SPF級實驗動物中心飼養。本實驗經動物實驗倫理委員會審核通過。

將小鼠隨機分為3組，每組11只。假手術組：小鼠開胸后對心臟前降支穿針但不進行結扎，1 d后腹部皮下注射生理鹽水。心肌梗死組：結扎小鼠心臟前降支構建心肌梗死模型，1 d后腹部皮下注射生理鹽水。心肌梗死+PTHrP組：結扎小鼠心臟前降支構建心肌梗死模型，1 d后腹部皮下注射PTHrP(87-139)，1 d后腹部皮下注射PTHrP(87-139)，劑量為80 μg/kg[8]。各組每日注射1次，持續注射4周后行后續實驗。

1.2 心臟功能檢測

高頻超聲圖像系統(Vevo 2100, 加拿大Visualsonics公司)檢測小鼠左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)、左室射血分數(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)。每個參數測量3次并且記錄平均值。

1.3 心肌肥厚以及肺淤血程度評估

稱量小鼠體質量后，分別取出小鼠的心臟和肺，清洗后稱量心臟和肺的質量。計算心臟質量/體質量和肺質量/體質量的比值。

1.4 免疫組織化學染色檢測CD31表達情況

將小鼠心臟心肌梗死邊緣區(假手術組為針穿部位)冠狀面切成片狀，部分用于免疫組織化學染色以及馬松染色，部分用于提取蛋白。

將石蠟切片浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽中進行抗原修復，滴加3%過氧化氫溶液后室溫避光靜置20～30 min，滴加10%正常羊血清，室溫封閉60 min以上。加入抗CD31抗體(1∶400)，4 ℃孵育過夜后，置于37 ℃冰箱復溫0.5 h，加羊抗鼠IgG二抗(1∶1 000)，室溫孵育60 min。加Elite ABC配制液于切片上，室溫孵育30 min，行二甲氨基偶氮苯(DAB)染色，蘇木素復染，1%鹽酸酒精液中分化2 s，沖洗，藍化，酒精脫水，封片。每張病理切片于顯微鏡下取左上、右上、中間、左下、右下各2 個不重疊視野。使用軟件Image-Pro Plus對圖像進行定量分析，分別計算CD31陽性點個數，并取各組平均值。

1.5 馬松染色檢測心肌纖維化

馬松染色按試劑盒內說明書操作：石蠟切片常規脫蠟至水，Weigert鐵蘇木素染色液染色5～10 min，酸性乙醇分化液分化5～15 s，Masson藍化液返藍3～5 min，麗春紅品紅液染色5～10 min，磷鉬酸溶液洗1～2 min，苯胺藍液染色1～2 min，酒精脫水，封片。每張病理切片于顯微鏡下取左上、右上、中間、左下、右下各2 個不重疊視野。使用軟件Image-Pro Plus對圖像進行定量分析，檢測陽性面積和整個視野面積，計算陽性面積百分率=陽性面積/檢測視野面積×100%，取各組陽性面積百分率平均值。

1.5 Western blot檢測多種血管相關因子表達情況

提取蛋白，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，轉膜，封閉，兔抗鼠VEGF抗體、血管內皮生長因子受體-2(VEGFR-2)抗體、堿性成纖維生長因子(bFGF)抗體(均1∶200)4 ℃孵育過夜，羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)孵育2 h，洗膜后，滴加顯影液，于Odyssey近紅外雙色掃描系統上顯影，使用ImageJ軟件分別測量各目標條帶和內參GAPDH的灰度值，計算蛋白的相對表達水平。

1.6 統計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTHrP(87-139)改善小鼠心肌梗死后心功能

與假手術組相比，心肌梗死組LVEF、LVFS顯著降低，LVEDD、LVESD明顯升高；與心肌梗死組相比，心肌梗死+PTHrP組LVEF、LVFS、LVEDD、LVESD等指標明顯改善(P均<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠超聲心動圖指標比較

2.2 PTHrP(87-139)減輕心肌梗死后心肌肥厚

與假手術組相比，心肌梗死組心臟質量/體質量和肺質量/體質量的比值明顯升高；與心肌梗死組相比，心肌梗死+PTHrP組心臟質量/體質量和肺質量/體質量的比值明顯降低(P均<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠心臟質量/體質量和肺質量/體質量的比值比較/mg·g-1

2.3 PTHrP(87-139)改善缺血性心肌間質纖維化

馬松染色結果，顯示心肌梗死組[(14.69±1.28)%]心肌梗死邊緣區的心肌纖維化程度較假手術組[(1.61±0.57)%]明顯升高，心肌梗死+PTHrP組[(6.52±0.80)%]心肌纖維化程度較心肌梗死組明顯降低(P均<0.05)，見圖1。

注：A為假手術組；B為心肌梗死組；C為心肌梗死+PTHrP組

2.4 PTHrP(87-139)促進心肌梗死后血管生成

與假手術組相比，心肌梗死組心肌梗死邊緣區CD31表達水平有輕微升高，但兩組間差異無統計學意義[(59.17±4.91)個陽性點對(54.83±4.79)個陽性點，P>0.05]；與心肌梗死組相比，心肌梗死+PTHrP組CD31表達水平[(111.17±12.34)個陽性點]明顯升高(P<0.05)，見圖2。

注：A為假手術組；B為心肌梗死組；C為心肌梗死+PTHrP組

2.5 PTHrP(87-139)促進多種血管相關因子生成

與假手術組相比，心肌梗死組VEGF、VEGFR-2、bFGF表達水平明顯降低；與心肌梗死組相比，心肌梗死+PTHrP組VEGF、VEGFR-2、bFGF表達水平則明顯升高(P均<0.05)，見圖3、表3。

3 討論

改善心肌血供是治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)尤其是心肌梗死的重要策略[9]。PTHrP及其受體分布于人體的各個組織器官，并通過自分泌、旁分泌及內分泌的方式，調節組織器官的生長及分化過程。體外細胞實驗及轉基因小鼠實驗表明，PTHrP參與調節細胞增殖、分化和凋亡，是骨骼、乳腺、牙齒和血管系統正常發育所必需的體液因子。研究證實，PTHrP具有促進血管生成的作用，能夠增強多種細胞中VEGF的表達和分泌[10]，也能促進移植體血管生成[11]。去除PTHrP的NLS和C末端，會影響VSMC的細胞周期，抑制血管新生內膜的形成[12]，提示PTHrP(87-139)可促進血管內膜形成，進而刺激血管生成。

促進血管生成改善血供對于缺血組織來說非常重要[13]。VEGF可通過調節血管生成信號，促使不成熟或雜亂無序的血管形成穩定和具有功能性的微血管網絡，從而恢復不同組織，特別是缺血組織的血流[14]。bFGF也是重要的血管生成因子，可誘導缺血心肌的血管生成，加快心肌梗死后的心臟修復[15]。在本研究中，小鼠持續皮下注射PTHrP(87-139) 4周后，心肌梗死邊緣區VEGF、VEGFR-2和bFGF表達上調，表明PTHrP(87-139)能夠促進血管生成。

圖3 各組小鼠心肌VEGF、VEGFR-2、bFGF蛋白表達水平

表3 各組小鼠心肌VEGF、VEGFR-2、bFGF蛋白表達水平比較

CD31是一種血小板-內皮細胞黏附分子，作為內皮細胞標志物，可在一定程度上反映血管生成密度，本研究顯示心肌梗死小鼠皮下注射PTHrP(87-139)后，心肌CD31表達水平上升，心功能改善，心肌間質纖維化程度降低，這表明PTHrP(87-139)對于抑制心肌梗死后重構具有重要意義。

PTHrP可舒張動脈血管床，如冠狀動脈、胃腸道相關動脈、腎動脈以及肺動脈，而這種作用與VSMC腺苷酸環化酶的激活和一氧化氮(NO) 的產生密切相關[16]。PTHrP 前體通過轉錄后剪接可產生成熟的N末端、中段、NLS以及C末端[17]。研究表明，NLS能夠進入細胞核發揮功能，刺激細胞增殖和抑制細胞凋亡，而C末端對于NLS發揮作用是不可或缺的[18]。PTHrP在NLS和C末端缺失時，可通過改變相關基因的表達，使細胞生長遲緩和早期衰老。NLS和C末端對于PTHrP發揮多種生理功能，尤其對促進VSMC增殖極為重要。然而，NLS和C末端組成的PTHrP(87-139)通過何種機制發揮以上作用，目前尚不明確，相關實驗表明可能與其調節p27基因密切相關。