PP2A對乳腺癌干細胞增殖、分化的影響

唐 煒*，張曉申，高 進，陳 倫，鄭文博

（廣州醫科大學附屬第一醫院乳腺外科，廣東 廣州 510120）

在我國沿海城市，乳腺癌的發病率逐年上升，已躍居為女性惡性腫瘤第一位[1]。引起乳腺癌轉移和治療抵抗的一個重要原因是存在著乳腺癌干細胞(breast cancer stem cells)。目前認為腫瘤干細胞自我更新增殖以及高度致瘤能力特征，是腫瘤復發和轉移的關鍵原因[2]。

近年研究發現了許多腫瘤干細胞維持自我更新和多向分化能力的信號通路，如Wnt、Notch、Hedgehog和Bmi等［3,4］。已知由蛋白磷酸酶2A調控激酶或關鍵分子的去磷酸化在調控腫瘤干細胞的“干性”中起重要作用。Neviani等人發現PP2A在慢性髓系白細胞的腫瘤干細胞中低表達，使用 PP2A 的活化藥物可降低處于靜止期的腫瘤干細胞生存和自我更新能力[5]。本研究擬通過檢測人乳腺癌中PP2A的表達情況，研究其表達對乳腺癌干細胞增殖和分化的影響，進一步闡明PP2A在乳腺癌發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2011年8月～2015年3月在廣州醫科大學附屬第一醫院乳腺外科接受手術治療的159例乳腺癌患者（均為女性）。年齡32～79歲，平均52歲。本試驗所有入選乳腺癌組織標本的收集均征得患者同意，并簽署知情同意書。

1.2 實驗材料

1.2.1 質粒、菌種和細胞

lentilox pll3.7，pCMV-VSV-G，pHR’8.9_VPR和大腸桿菌DH5感受態細菌由本實驗室保存及構建。本實驗所使用的乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7和HEK-293T細胞購自美國ATCC。

1.2.2 試劑

Trizol（Invitrogen，美國），PrimeScript RT reagent kit（TAKARA，日本），B27 （Invitrogen，美國），牛血清白蛋白（Sigma，美國），lipofectamine 2000（Invitrogen，美國），anti-Sox2抗體（Abcam，美國），anti-Oct4抗體（Abcam，美國）,氯仿、異丙醇、無水乙醇、DEPC均購于廣州威佳公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時定量RT-PCR檢測PP2A表達量

PP2A以及GAPDH引物序列如下：

PP2A：

5’-AAGAGAGAGGAGGAGAGGGA-3’，

5’-GCCAGGAGGACCTCATCTTC-3’，

GAPDH：

5’-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA-3’，

5’-GGGTGGAATACATTGGAACATGT-3’。

每個檢測樣本做3個復孔，在LightCycler480 Realtime PCR儀上進行實時定量PCR，最終得到標準曲線和PP2A/GAPDH的相對值。

1.3.2 構建穩定轉染細胞系

挑選已證實有生物學作用的si-PP2A序列經T4 DNA連接酶連接過夜后轉化E.coli DH5感受態細菌，氨芐青霉素篩選培養，挑取陽性克隆進行酶切鑒定，得到載體lenti-PP2A-shRNA。將載體和輔助病毒載體轉染到HEK-293T細胞，收集病毒液后感染MDA-MB-231和MCF-7細胞。通過流式細胞儀分選系統分選GFP陽性的細胞，即為穩定轉染細胞系。

1.3.3 球囊形成實驗

將MDA-MB-231和MCF-7細胞消化后，用球囊培養基在低粘附96孔板中培養，每孔1000個細胞，生長7天后數球囊個數。

1.3.4 Western-blotting

提取細胞總蛋白。制備電泳SDS凝膠后，每個泳道加入10～50 ug的提取蛋白，電泳，轉移至PVDF膜，洗膜，孵育一抗，洗膜，用連接辣根過氧化酶的對應的IgG二抗孵育。抗原抗體結合用化學發光劑觀測。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 乳腺癌中PP2A的表達

使用實時定量RT-PCR對159例乳腺癌患者組織檢測其PP2A的含量，在患者腫瘤組織中，PP2A的表達（0.650±0.296）低于癌旁組織（4.786±2.838）（圖1）。t檢驗得出；差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 PP2A在乳腺癌組織和癌旁組織的相對表達量， *：P＜0.01。

2.2 PP2A表達降低對乳腺腫瘤細胞球囊形成率的影響

在MDA-MB-231細胞中，mock和sh-GFP組的球囊形成率分別為：6.67±0.58和6.33±1.53個，在PP2A低表達的穩轉株中，球囊形成率分別為26.67±2.52和30.33±6.11個。在MCF-7細胞株中，四組的球囊形成率分別為5±1.73、5.67±2.52、23.33±2.52和22.33±5.69。表明穩轉細胞株中，PP2A降低能升高乳腺癌干細胞的球囊形成率，即提高了乳腺癌干細胞的增殖能力；差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 sh-PP2A穩轉乳腺癌細胞株的球囊形成率。

2.3 PP2A對乳腺癌干細胞標記物的影響

我們使用Western blotting檢測實驗組和對照組的Sox2和Oct4這兩個乳腺癌干細胞標記物的表達水平。發現穩轉株中，Sox 2和Oct4的蛋白表達升高，表明PP2A的低表達維持了乳腺癌干細胞的“干性”，降低了干細胞的分化能力。

3 討 論

蛋白磷酸酶是具有催化已經磷酸化的蛋白發生去磷酸化反應的一類酶分子，與蛋白激酶相對應存在，通過去磷酸化在細胞特定的時相調控蛋白質的活性和信號通路的激活獲抑制。而PP2A是真核生物中最主要的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶[6]。PP2A核心酶（A和C亞基）與不同的調節B亞基形成功能特異的全酶－三聚體復合物，目前至少存在75種由不同亞基組合形成的PP2A全酶，因此PP2A核心酶的異常表達或調控亞基B的功能缺失會引起特異的信號通路的功能紊亂[7]。迄今，大量研究證實PP2A在細胞周期、細胞凋亡、基因轉錄等方面的調控起重要作用。PP2A還與TOR通路、ERK通路以及Wnt信號通路均有關。

有關PP2A在腫瘤生長和遷移的作用已經有報道。在小鼠為模型的實驗中，PP2A強有力的抑制劑岡田酸（Okadaic acid，OA）可激活PP2A下游的MAPK通路和ERK通路而有效地促進腫瘤的發生[7]。另外，在胃腸道間質瘤中，PP2A的突變，可以促進Akt1/2，ERK1/2，and WNK1等血管生成相關通路的磷酸化，導致腫瘤加速生。而我們的實驗表明，乳腺癌患者中癌組織的PP2A表達量要低于癌旁組織。進一步的體外實驗表明PP2A的功能缺失增強了乳腺癌干細胞的增殖和自我更新能力。上述研究結果提示，PP2A可能是抑制乳腺癌干細胞“干性”的重要分子，這種作用可能通過介導信號通路中關鍵分子的去磷酸化來實現。

本研究初步證明了PP2A在乳腺癌組織中低表達,有類似抑癌基因的作用, 降低乳腺癌細胞系干細胞PP2A的表達，能促進腫瘤干細胞的增殖，抑制其分化。但PP2A通過哪些信號通路影響腫瘤干細胞的“干性”仍需要進一步的研究。本研究為PP2A作為靶向腫瘤的分子治療提供了重要的實驗依據，說明PP2A具有成為乳腺癌基因治療新靶點的潛力。