谷氨酸脫氫酶與幾種腫瘤的關(guān)系

侯海，羅超，陳中豪，鄧旭東，孫瑤，王祥喜

1 西北工業(yè)大學(xué) 空間生物實(shí)驗(yàn)?zāi)M技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室 生命學(xué)院，陜西 西安 710072

2 中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所 生物大分子國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

谷氨酸脫氫酶 (Glutamate dehydrogenase，GDH) (E.C.1.4.1.2–1.4.1.4) 是一種線粒體酶，普遍存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)[1-2]，屬于氨基酸脫氫酶超家族[3]，在生物體氮和碳的代謝過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4]。一般情況下，該酶以NAD+和/或NADP+作為輔酶催化L-谷氨酸可逆氧化脫氨，生成ɑ-酮戊二酸，從而參與三羧酸循環(huán) (TCA循環(huán))、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氮和碳代謝的調(diào)節(jié)及其他生理活動(dòng)[5-6]。在能量調(diào)節(jié)、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等方面具有重要作用。

1 GDH的分類

1.1 根據(jù)寡聚體狀態(tài)分類

現(xiàn)有研究報(bào)道已從多種類型的生物體內(nèi)分離得到谷氨酸脫氫酶，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。依照寡聚體的狀態(tài)，谷氨酸脫氫酶可以被分為2種類型：細(xì)菌和真菌的NADP (H) 特異性谷氨酸脫氫酶以及脊椎動(dòng)物的NAD (H)/NADP (H) 雙特異性谷氨酸脫氫酶。這些GDH均以同源六聚體的形式發(fā)揮功能，每個(gè)亞基的分子量約為48 kDa (細(xì)菌) 或50 kDa (脊椎動(dòng)物)；而NAD (H) 特異性谷氨酸脫氫酶既存在亞基分子量約為48 kDa的同源六聚體蛋白 (例如消化鏈球菌、共生梭菌)，也存在亞基分子量約為115 kDa的同源四聚體蛋白 (例如釀酒酵母、粗糙鏈孢菌)[7-8]。

1.2 根據(jù)輔酶的特異性分類

谷氨酸脫氫酶在催化L-谷氨酸的氧化脫氨基反應(yīng)時(shí)需要NAD+/NADP+作為輔酶，根據(jù)輔酶特異性不同，谷氨酸脫氫酶可以被分成3類：NAD (H)特異性谷氨酸脫氫酶、NADP (H) 特異性谷氨酸脫氫酶以及NAD (H)/NADP (H) 雙特異性谷氨酸脫氫酶。不同特異性的谷氨酸脫氫酶在功能上存在不同的偏向性，NAD (H) 特異性谷氨酸脫氫酶主要參與谷氨酸的分解代謝，NADP (H) 特異性谷氨酸脫氫酶通常在氨的合成代謝中發(fā)揮作用[9]。而NAD (H) /NADP (H) 雙特異性谷氨酸脫氫酶在發(fā)揮催化作用時(shí)會(huì)受到一些小分子 (如ATP和GTP) 的變構(gòu)調(diào)節(jié)作用。ATP能夠通過(guò)輔助產(chǎn)物的釋放加快催化反應(yīng)的速率，而GTP則會(huì)阻止產(chǎn)物的釋放從而對(duì)催化反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用[10]。

2 GDH與腫瘤的關(guān)系

腫瘤的典型特征是異常的能量代謝和無(wú)限增殖。人類腫瘤在癌變期間獲得6種生物學(xué)能力，包括維持增殖信號(hào)、預(yù)防生長(zhǎng)抑制、抵制細(xì)胞死亡、無(wú)限復(fù)制、促進(jìn)新血管形成及激活侵襲和轉(zhuǎn)移，這些特征導(dǎo)致了腫瘤疾病的復(fù)雜性。除了癌細(xì)胞之外，腫瘤還表現(xiàn)出另一方面的復(fù)雜性：它們具有征募性，即表面上正常的細(xì)胞可以通過(guò)創(chuàng)建一個(gè)“腫瘤微環(huán)境”來(lái)幫助其得到標(biāo)志性特征[11]。

許多研究表明，雖然谷氨酰胺可以在大多數(shù)組織中合成，但其需求量往往超過(guò)供應(yīng)量。谷氨酰胺通常是細(xì)胞增殖的必需營(yíng)養(yǎng)物[12-13]。越來(lái)越多的研究表明，谷氨酰胺代謝在腫瘤生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移中有著重要作用[14-17]，在許多癌細(xì)胞中，谷氨酰胺是主要的線粒體底物，并且生成維持線粒體膜電位和完整性以及支持氧化還原大分子合成所必需的NADPH[12]。GDH是谷氨酰胺代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，所以GDH對(duì)于腫瘤細(xì)胞也十分重要。人體內(nèi)存在2種類型的GDH，即GDH1和GDH2，它們具有高度的序列相似性[18]。GDH1在許多組織或細(xì)胞中都有廣泛表達(dá)；而GDH2則在大腦、睪丸、胚胎組織和各種癌細(xì)胞中表達(dá)[19-20]。研究表明，GDH1主要調(diào)控癌細(xì)胞內(nèi)ɑ-酮戊二酸的生成，它通過(guò)控制細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物α-酮戊二酸和隨后的代謝物富馬酸鹽的水平 (富馬酸鹽結(jié)合并激活活性氧物質(zhì)清除酶谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1)，為癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)提供代謝優(yōu)勢(shì)。此外，GDH1在維持癌細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[21]，通過(guò)短發(fā)夾RNA (shRNA) 或小分子抑制劑R162靶向GDH1可以導(dǎo)致細(xì)胞中的氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，從而達(dá)到阻礙癌細(xì)胞增殖和抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。GDH2可以誘導(dǎo)增加細(xì)胞內(nèi)谷氨酸的水平，谷氨酸由氨和α-酮戊二酸合成。此外，Yukiko等發(fā)現(xiàn)在補(bǔ)充氨的谷氨酰胺消耗條件下，表達(dá)GLUD2 (編碼GDH2的基因) 的PC3和Hs578T細(xì)胞的增殖速率增加[14]。所以可以嘗試抑制體內(nèi)GDH的活性和表達(dá)水平來(lái)抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。

2.1 GDH與乳腺癌

乳腺癌是全球婦女最常見的癌癥之一。除皮膚癌以外，乳腺癌是目前美國(guó)婦女中最常見的癌癥，約占癌癥患者的1/3[22]。美國(guó)每年約有205 000例新增乳腺癌病例被診斷出來(lái)，其中約有4萬(wàn)名病人會(huì)死于此病[23]。Jessica等研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中GDH的表達(dá)量增加，特別是雌激素受體陽(yáng)性(ER+) 乳腺癌細(xì)胞與其他乳腺癌細(xì)胞亞型相比，其中的GDH表達(dá)水平上升更為顯著。他們?cè)趯?shí)驗(yàn)中通過(guò)利用shRNA抑制細(xì)胞中GDH的表達(dá)水平，用15N-谷氨酰胺培養(yǎng)后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行含氮代謝物掃描，發(fā)現(xiàn)人類乳腺癌細(xì)胞主要通過(guò)GDH催化還原胺來(lái)同化氨，從而加速乳腺癌細(xì)胞的擴(kuò)散[24]。Ryu等通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在犬類乳腺腫瘤細(xì)胞中GDH的表達(dá)量也有一定的上升[23]。因此，特異地抑制乳腺癌細(xì)胞中的GDH表達(dá)水平及其活性可能具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖與擴(kuò)散的潛力。

2.2 GDH與膠質(zhì)瘤

膠質(zhì)瘤 (Glioma) 是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，約占惡性腦腫瘤的81%[25]。據(jù)統(tǒng)計(jì)每年約有22 000名美國(guó)人被診斷為惡性膠質(zhì)瘤，也是治療方案最具挑戰(zhàn)性的癌癥之一。目前對(duì)于這些原發(fā)性腦癌的治療是不充分的，大約95%的患者在確診后5年內(nèi)會(huì)死于該疾病[26]。已有研究報(bào)道谷氨酸在神經(jīng)膠質(zhì)瘤生理活動(dòng)中具有許多重要的作用，例如，作為多向生長(zhǎng)因子、空間興奮性毒素等[27]。最近的研究表明，細(xì)胞外谷氨酸濃度增加是導(dǎo)致80%的原發(fā)性腦腫瘤患者發(fā)生腫瘤相關(guān)性癲癇的原因[28]。Yang等通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在葡萄糖被剝奪條件下帶來(lái)的糖酵解障礙中需要GDH才能存活[29]。Chen等發(fā)現(xiàn)GDH1和GDH2在人類異檸檬酸脫氫酶1 (Isocitrate dehydrogenase 1，IDH1) 突變型膠質(zhì)瘤IDH1R132H中的表達(dá)量呈現(xiàn)異常升高，他們分別使用sh647和sh662這兩種shRNA靶向構(gòu)建到編碼GDH的基因中 (即敲低GLUD1和GLUD2) 以確定GLUD1和GLUD2是否有助于IDH1R132H神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示使用sh647后會(huì)導(dǎo)致GDH1/2的含量下降；使用sh662后幾乎檢測(cè)不到GDH1/2的量，最后通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)于GLUD1和GLUD2的依賴性，然后他們使用識(shí)別GLUD1和GLUD2的抗體對(duì)小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤祖細(xì)胞的培養(yǎng)物進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)烈的免疫性，確定GLUD2可以改善突變型IDH1的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)[30]。

2.3 GDH與結(jié)直腸癌

結(jié)直腸癌 (Colorectal carcinoma，CRC) 是第三大常見的新型癌癥，其死亡率也排在癌癥中的第3位[31]，是死亡率較高的癌癥之一。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，診斷為局部結(jié)直腸癌患者的5年生存率為90%，局部擴(kuò)散后下降為68%，遠(yuǎn)距離擴(kuò)散后急劇下降到10%[32]。Liu等發(fā)現(xiàn)，GDH在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平比相應(yīng)的非腫瘤細(xì)胞高，GDH過(guò)度表達(dá)與結(jié)直腸癌的遷移能力和腫瘤大小有關(guān)，GDH表達(dá)水平越高，腫瘤遷移能力越強(qiáng)，腫瘤尺寸越大，當(dāng)用shRNA抑制編碼GDH的基因后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移能力明顯下降[33]。此外，敲除GDH編碼基因后顯著減弱了STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) 的磷酸化，減少了Vimentin和ZEB1的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)了CRC細(xì)胞中E-鈣粘著蛋白的表達(dá)，他們發(fā)現(xiàn)GDH通過(guò)STAT3介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT) 誘導(dǎo)促進(jìn)CRC細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，從而對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)控作用 (圖1)。

圖1 GDH與CRC細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的關(guān)系Fig.1 Relationship between GDH and CRC cell motility.

2.4 GDH與卵巢癌

卵巢癌 (Ovarian cancer，OVCA) 是全球女性中第八大常見癌癥，2014年美國(guó)估計(jì)有21 980例新發(fā)病例和14 270例死亡病例[34]。由于缺乏特定的癥狀和充足的篩查試驗(yàn)，患者常常在晚期才被診斷出來(lái)，所以卵巢癌在所有婦科惡性腫瘤中最為致命。大多數(shù)原發(fā)性卵巢惡性腫瘤來(lái)源于上皮細(xì)胞，約5%的卵巢癌來(lái)自其他類型的卵巢細(xì)胞[35]。Yuan等使用雷帕霉素處理3種卵巢癌細(xì)胞24 h后，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素抑制了GDH活性和谷氨酰胺酶 (GLS) 的表達(dá)。此外，他們還發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺通過(guò)調(diào)節(jié)mTOR/S6和MAPK途徑來(lái)增加GLS和GDH的活性[36]。Yang等發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺調(diào)節(jié)STAT3的活化，STAT3是調(diào)節(jié)侵襲性卵巢癌細(xì)胞癌癥標(biāo)志的信號(hào)通路的介質(zhì)。其研究結(jié)果表明，通過(guò)阻斷谷氨酰胺進(jìn)入TCA循環(huán)來(lái)靶向高侵入性O(shè)VCA細(xì)胞，以及通過(guò)抑制谷氨酰胺和STAT3合成來(lái)靶向低侵入性O(shè)VCA細(xì)胞的聯(lián)合方法可能會(huì)成為OVCAs的潛在治療方法[14]。如前所述，GDH是谷氨酰胺代謝途徑的關(guān)鍵酶，提高GDH活性可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷移，用分子靶向干預(yù)谷氨酰胺代謝可能被作為一種治療卵巢癌的有效方式。

2.5 GDH與其他類型的癌癥

2.5.1 肝癌

肝細(xì)胞癌 (Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第五大常見的癌癥[37]。Robert等研究發(fā)現(xiàn)，在肝病患者中，肝癌細(xì)胞的GDH活性顯著低于相鄰的正常肝細(xì)胞或肝硬化肝細(xì)胞中GDH的活性，此外，所有腫瘤細(xì)胞的總體GDH活性低于正常和肝硬化肝臟細(xì)胞活性的30%[38]。在肝細(xì)胞壞死和線粒體解體后，GDH會(huì)逸出細(xì)胞進(jìn)入血液，肝癌患者的血漿GDH升高是最為明顯的，因此，測(cè)定血清中GDH活性和含量可以用作線粒體損傷和肝細(xì)胞病變?cè)\斷的指標(biāo)。

2.5.2 肝外膽管癌

由于早期診斷困難，膽管癌的預(yù)后較差，隱性起病和亞臨床癥狀導(dǎo)致存活率低[39-40]。研究表明，新的輔助化療結(jié)合根治性膽管癌手術(shù)提高了患者的長(zhǎng)期生存率[41]。但對(duì)于不可切除的肝外膽管癌，化療和放療均無(wú)明確療效。迄今為止，還沒(méi)有充分的證據(jù)證明化療能顯著改善外發(fā)性膽管癌患者的生存率[42]。大多數(shù)無(wú)法切除腫瘤的患者在確診后12個(gè)月內(nèi)由于惡病質(zhì)和身體狀況不佳而死亡。Su等研究表明，與正常膽管組織相比，肝外膽管癌組織中的GDH表達(dá)增加。他們發(fā)現(xiàn)沉默GDH后肝外膽管癌細(xì)胞的遷移能力顯著降低，并且能夠顯著提高肝外膽管癌細(xì)胞的凋亡率[43]。此外，GDH可能通過(guò)Smad信號(hào)通路介導(dǎo)的TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)促進(jìn)肝外膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。找到一種能有效抑制GDH表達(dá)水平或酶活性的方法可能具有抑制和治療肝外膽管癌的潛力。

2.5.3 肺癌

肺癌是世界上癌癥相關(guān)死亡的主要原因。肺癌可以概括地分為小細(xì)胞肺癌 (SCLC) 和非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) ，分別占患者人數(shù)的15%和85%[44]。根據(jù)英國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局2014年的報(bào)告，診斷為小型局限性腫瘤的肺癌患者的1年生存率為81%–85%，而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肺癌患者1年生存率僅為15%–19%[44]。在Michalak等的研究中觀察到與小細(xì)胞肺癌和大細(xì)胞癌相比，鱗狀細(xì)胞肺癌患者的血清GDH活性降低，肺癌患者中的體液免疫反應(yīng)與降低血清GDH活性有關(guān)[45]。所以通過(guò)谷氨酸代謝途徑治療肺癌可能具有一定的應(yīng)用前景。

3 展望

GDH是谷氨酰胺代謝的關(guān)鍵酶，谷氨酰胺在GDH的作用下轉(zhuǎn)化為ɑ-酮戊二酸進(jìn)入TCA循環(huán)，產(chǎn)生ATP，從而為癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖提供能源支持。隨著研究的發(fā)展，越來(lái)越多的證據(jù)表明，GDH與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、入侵等活動(dòng)密切相關(guān)，在許多腫瘤細(xì)胞中都存在表達(dá)異常上升的現(xiàn)象。GDH在逐漸成為癌癥治療方面具有潛力的作用靶點(diǎn)，有關(guān)GDH抑制劑的篩選可能會(huì)逐漸成為研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，mTOR1 (Mammalian target of rapamycin 1) 通過(guò)激活GDH促進(jìn)谷氨酰胺分解從而抑制人去乙酰化酶4 (SIRT4)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生[46]；shRNA和小分子抑制劑R162能夠有效地抑制GDH，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移等生理活動(dòng)。此外，研究發(fā)現(xiàn)EGCG(Epigallocatechin gallate) 是一種典型的GDH變構(gòu)抑制劑，能明顯抑制GDH的活性，從而有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)和增殖[47]。越來(lái)越多的研究表明，GDH在作為癌癥治療的新靶點(diǎn)中有著相當(dāng)?shù)臐摿Α５牵P(guān)于GDH含量變化與腫瘤發(fā)生和發(fā)展之間的病理關(guān)系尚不完全清楚，還需要更進(jìn)一步的研究。我們推測(cè)，正是由于GDH與腫瘤發(fā)生的關(guān)系十分密切，有關(guān)GDH和腫瘤發(fā)生的關(guān)系研究將會(huì)是一個(gè)熱點(diǎn)，篩選或研制能有效針對(duì)腫瘤細(xì)胞中GDH活性的藥物也將具有巨大的開發(fā)和應(yīng)用前景。